本实验用微量全血法测定了四组小鼠外周全血中T淋巴细胞亚群 ,同时测定脾脏来源T、B淋巴细胞对ConA及LPS增殖反应 ,从而在数量及功能两方面研究了桂枝汤对痹证小鼠T淋巴细胞的影响。1 材料和方法1 1 动物的分组选用雄性DBA小鼠 80只随机分为四组 ,每组2 0只 ,分别为正常组、模型组、桂枝汤高剂量组、桂枝汤低剂量组。1 2 痹证模型的制备将Ⅱ型胶原溶于 0 1M的乙酸中 ,配成浓度为2mg mlⅡ型胶原溶液 ,此溶液再与等量完全弗氏佐剂混合为Ⅱ型胶原浓度 1mg ml溶液 ,将此溶液充分乳化 ,以滴加于水中不扩散为度。免疫模型组及桂枝汤高、低剂量组小鼠 ,按 5 0 μg 足 只小鼠行双侧足底皮下注射上述Ⅱ型胶原乳化物 ,正常组小鼠足底注射生理盐水对照。1 3 给药方法选用桂枝汤原方 :桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣 ,上述各药以 10∶10∶7∶10∶10配伍比例 ,常规混合采用水煮醇沉法制得汤药 ,按小鼠体表面积折算 ,桂枝汤高剂量组为 30g生药 kg体重 ,低剂量组为 8 75g生药 kg体重 ,正常及模型组给予生理盐水灌胃 ,每日一次 ,于造模后两周开始给药 ,连续 3周。1 4 荧光标记、流式细胞仪计数法测定T淋巴细胞亚群在每只试管中加入浓度为 5 0 0u ml肝素钠 10 0ul抗凝。每只小鼠取全血加入两个有肝素钠的试管中各 10 0ul ,随后各加入 5 .5ulCD3 CD4、CD3 CD8荧光标记的单克隆抗体 ,放入 4℃冰箱 ,30min。加入红细胞裂解液 ,每管 3ml混匀 ,10 0 0rpm离心 5min。弃上层液体 ,加入PBS缓冲液 4～ 5ml混匀 ,10 0 0rpm离心5min。以上操作重复 2～ 3遍。弃上层液体 ,加入PBS恢复体积至 1ml ,用流式细胞仪检测T细胞亚群数。1 5 MTT法测定脾脏中T、B淋巴细胞增殖功能无菌条件下取出小鼠脾脏 ,用眼科剪充分剪碎 ,加 3mlPBS缓冲液混匀 ,用 2 0 0目尼龙网过滤。加入分离液 ,分离出单个核细胞层。取出分离层中细胞 ,加PBS调细胞数为 1× 10 5 ml。以 16 40培养液培养细胞 ,96孔板每孔 2 0 0ul,以ConA(5ug ml)、LPS(2 5ug ml)分别刺激T、B淋巴细胞。在CO2 培养箱内培养 4 8h后加 10ulMTT ,继续培养 4h。每孔加入 10 0ul 0 0 4M盐酸异丙醇终止反应。酶标仪在 5 70～ 6 30nm下测试其OD值。1 6 统计学处理实验结果用均数±标准差 ( x±s)表示 ,运用Stata软件进行统计学处理 ,采用方差分析进行比较。P <0 .0 5有显著性意义。2 结果2 1 不同组别小鼠外周血T细胞亚群数变化由上表看出 ,CD3:模型组高于正常组、桂枝汤高剂量组和桂枝汤低剂量组。CD4 :模型组高于正常组、桂枝汤高剂量组和桂枝汤低剂量组。CD8:正常组与模型组间无差异 ;模型组高于桂枝汤高剂量组和桂枝汤低剂量组。CD4 CD8:模型组高于正常组 ;模型组与桂枝汤高、低剂量组间比较无差异。表 1 小鼠T淋巴细胞亚群变化组 别样本数CD3CD4CD8CD4 CD8正常组 10 6 6 .5 8± 5 .76 4 8.2 4± 5 .0 71 13.84± 2 .17 3.6 0± 0 .82 2 模型组 10 72 .5 8± 3.90 5 6 .86± 3.817 12 .5 9± 1.74 4 .5 8± 0 .6 35 桂高组 10 5 1.5 0± 5 .35 △△ 4 1.11± 3.886 △△ 8.75± 2 .2 5 9 △△ 5 .0 3± 1.5 2 9桂低组 10 5 3.91± 6 .0 2 △△ 4 3.33± 6 .0 4 6 △△ 9.96 8± 2 .2 4 .5 1± 0 .978 注 :与正常组比较 : P <0 0 5 , P <0 0 1;与模型组比较 :△△ P <0 0 12 2 不同组别小鼠脾脏中淋巴细胞对ConA和LPS增殖变化用得到的原始数据除以相应的对照孔的数据得出四组增殖系数 ,将这四组增殖系数进行分析得出下表中的结果。表 2 小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖实验增殖系数结果组 别样本数ConA组LPS组正常组 10 1.0 836± 0 .0 776 1.115 6± 0 .0 912模型组 10 1.2 5 13± 0 .0 85 8 1.0 0 5 1± 0 .0 4 5 9桂高组 10 1.15 12± 0 .0 6 6 81.0 5 2 2± 0 .14 34桂低组 10 1.2 70 5± 0 .0 94 7 #1.114 5± 0 .14 75 注 :与正常组比较 : P <0 0 1;与桂枝汤高剂量组比较 :#P <0 0 5由上表中可以看出脾脏来源的T淋巴细胞对ConA激活的增殖反应系数模型组高于正常组 ;模型组与桂枝汤高剂量组、桂枝汤低剂量组间无统计学差异 ;桂枝汤高剂量组低于桂枝汤低剂量组。B淋巴细胞对LPS增殖反应系数各组间比较无统计学意义。3 讨论CD4 + CD8+ T细胞之比上升反应机体的免疫功能上调 ,模型组CD4 + CD8+ T细胞之比上升表明痹证模型组免疫应答的正调节占优势 ,说明痹证小鼠针对Ⅱ胶原的免疫应答被激活。同时应用桂枝汤后痹证小鼠外周全血中CD4 + T细胞和CD8+ T细胞数量降低 ,显示桂枝汤有下调外周细胞免疫的作用。脾脏属机体外周免疫器官 ,在本实验中由Ⅱ胶原免疫后导致了小鼠脾脏来源的T淋巴细胞对ConA激活的增殖功能增强 ,而用桂枝汤后脾脏中T细胞增殖功能被抑制 ,表明外周T细胞免疫的功能被抑制。B淋巴细胞对LPS增殖反应功能变化不明显 ,说明桂枝汤发挥抑制免疫的主要途径可能是通过抑制细胞免疫的功能来实现。另外 ,中医认为痹证发生为“风、寒、湿三气杂至 ,和而为痹” ,同时认为痹证发病与营卫不和相关联 ,桂枝汤功能核心是调和营卫 ,在本实验中桂枝汤功能表现为调节免疫 ,故而得出结论营卫不和可能与免疫功能紊乱相关联。桂枝汤对痹证小鼠T淋巴细胞的调节作用@周桂琴$中国中医研究院基础所!北京100700
@张浩$中国中医研究院基础所!北京100700
@周静$中国中医研究院基础所!北京100700
@张丽坤$中国中医研究院基础所!北京100700
@滕静如$中国中医研究院基础所!北京100700
@王少君$中国中医研究院基础所!北京100700
@李艳$中国中医研究院基础所!北京100700
@潘静华$中国中医研究院基础所!北京100700
@鞠大宏$中国中医研究院基础所!北京100700
@吕爱平$中国中医研究院基础所!北京100700桂枝汤;;痹证;;T淋巴细胞亚群;;淋巴 细胞增殖目的:探讨桂枝汤对痹证T淋巴细胞的调节作用。方法:外周全血中T淋巴细胞亚群用免 疫荧光标记流式细胞仪计数,脾脏中T、B淋巴细胞增殖功能用MTT法测定。结果:外周全血中CD3+T、CD4 + T、CD8+ T细胞在应用桂枝汤后数量均降低,脾脏来源的T淋巴细胞对丝裂原刀豆蛋白A(ConA)激活的 增殖反应系数应用桂枝汤后降低,B淋巴细胞对丝裂原细菌脂多糖(LPS)激活的增殖反应系数 应用桂枝汤后无变化。结论:桂枝汤能减少外周血中T淋巴细胞的数量且对脾脏中T淋巴细胞的功能具有抑制作用。国家自然科学基金课题(3 0 17113 3 )和相关联 ,桂枝汤功能核心是调和营卫 ,在本实验中桂枝汤功能表现为调节免疫 ,故而得出结论营卫不和可能与免疫功能紊乱相关联。桂枝汤对痹证小鼠T淋巴细胞的调节作用@周桂琴$中国中医研究院基础所!北京100700
@张浩$中国中医研究院基础所!北京100700
@周静$中国中医研究院基础所!北京100700
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@吕爱平$中国中医研究院基础所!北京100700桂枝汤;;痹证;;T淋巴细胞亚群;;淋巴 细胞增殖目的:探讨桂枝汤对痹证T淋巴细胞的调节作用。方法:外周全血中T淋巴细胞亚群用免 疫荧光标记流式细胞仪计数,脾脏中T、B淋巴细胞增殖功能用MTT法测定。结果:外周全血中CD3+T、CD4 + T、CD8+ T细胞在应用桂枝汤后数量均降低,脾脏来源的T淋巴细胞对丝裂原刀豆蛋白A(ConA)激活的 增殖反应系数应用桂枝汤后降低,B淋巴细胞对丝裂原细菌脂多糖(LPS)激活的增殖反应系数 应用桂枝汤后无变化。结论:桂枝汤能减少外周血中T淋巴细胞的数量且对脾脏中T淋巴细胞的功能具有抑制作用。国家自然科学基金课题(3 0 17113 3 )
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