自从１９７８年Ｃａｌａｈａｍ等［１］人首次从香蕨木根瘤中成功地分离出弗兰克氏菌纯培养以来 ，陆续有人从多种非豆科植物根瘤中分离到了弗兰克氏菌的纯培养菌株。但到目前为止，对纯培养 的固氮生理学研究还不多。作者对木麻黄根瘤内生菌Ｃｅｌ５１７菌株的固氮生理学进行了研究， 现将结果报道如下。１材料和方法１１菌株弗兰克氏菌Ｃｅｌ５１７菌株系我们从木麻黄根瘤中 ［２］用四氧化锇灭菌法进行根瘤表面灭菌，用适当的培养液进行培养，分离出来的纯培养菌株。 经回接原宿主植物的实生苗，形成具有固氮活性的根瘤，证明该菌确系木麻黄根瘤内生菌。１２ 培养基菌体活化培养基由下列物质组成：Ｋ２ＨＰＯ４，ＮａＨ２ＰＯ４，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ，ＫＣｌ，ＣａＣＯ３，蛋白胨，丙酮酸，微量元素及维生素，用ＮａＯＨ调ｐＨ值为６８。无 氮限定培养基在活化培养基中去掉蛋白胨与丙酮酸，加丙酸，调ｐＨ值为６８。１３固氮酶的 诱导及固氮酶活性的测定Ｃｅｌ５１７菌株在活化培养基中静置培养两周后，离心收集菌体，无菌 水洗涤３次，用研磨器研磨菌体，用无氮限定培养液稀释成适当浓度的菌悬液，取０５ｍｌ接种 于盛有１５ｍｌ限定培养液的５０ｍｌ三角瓶中，塞棉塞，置２８℃保温箱中培养５ｄ，诱导泡囊 产生。用反口橡皮塞封口，抽真空，注入含有１０％的氧气，１０％的乙炔气及８０％氩气的混合 气体，置２８℃，４０ｒ／ｍｉｎ转床反应一定时间后，用岛津ＧＣ—５ＡＰ型气相色谱仪测定乙 烯生成量表示固氮酶活性，菌体收集后用Ｌｏｗｒｙ等人的方法测定菌体蛋白量。１４制片与观 察参照参考文献［３］的方法。２结果与分析图１Ｃｅｌ５１７菌株的固氮活性周期２１Ｃｅｌ ５１７菌株的固氮活性周期Ｃｅｌ５１７菌株在无氮限定培养液中经诱导培养后，全部换塞换气置 转床反应，逐日测定固氮酶活性（图１）。从开始反应到１８０ｈ固氮活力一直上升，到１８０ｈ 达到高峰，以后逐渐下降。在无氮限定培养液中菌体生长的氮素来源全靠固氮作用来提供，由于固 氮所消耗的能量很大，所以固氮周期的形成可能是碳源限制的结果，如果继续补充碳源，菌体可能 会继续生长，固氮酶活性将持续更长的时间。２２碳源对固氮酶活性的影响以柠檬酸、琥珀酸、 乙酸钠、丙酮酸及葡萄糖分别替代无氮限定培养液中的乙酸，观察不同碳源对该菌固氮酶活性的影 响（表１）。结果表明，丙酸是最好的碳源，乙酸钠、丙酮酸次之，葡萄糖表现出较低的固氮酶活 力，柠檬酸、琥珀酸不能诱导出固氮酶活性。这一结果与Ｔｊｅｐｋｅｍａ等人所作的Ｃｐｌ１ 菌株结果相反（分离自香蕨木根瘤的Ｃｐｌ１菌株，用琥珀酸作碳源时，获得较高的固氮酶活性） 。这说明，来源不同的Ｆｒａｎｋｉａ菌株，在诱导固氮酶产生时，必须选择适宜的碳源。表１不 同碳源对Ｃｅｌ５１７菌株固氮酶活性的影响碳源丙酸乙酸钠丙酮酸葡萄糖柠檬酸琥珀酸乙炔还原 活性（ｎｍｏｌＣ２Ｈ４／ｍｇ·蛋白质·ｈ）７３８１１２９２１２３２００２３氮源对 固氮酶活性的影响在无氮限定培养液中，分别加入不同量的蛋白胨或ＮＨ４Ｃｌ，经诱导培养后上 转床，反应５ｄ，测定固氮酶活性（表２）。表２氮源对Ｃｅｌ５１７菌株固氮酶活性的影响氮源 不加氮源蛋白胨（ｍｇ／ｍｌ）ＮＨ４Ｃｌ（ｍＭ）０１０５１００１０５１０１０ 乙炔还原活性（ｎｍｏｌＣ２Ｈ４／ｍｇ·蛋白质·ｈ）７３８２６０７７７３１６６１５２ ８４１０５９０结果表明，蛋白胨加入量为０１ｍｇ／ｍｌ时则明显地抑制了菌株的固氮酶活 性，随着加入量的增加，酶活力逐渐下降。ＮＨ４Ｃｌ加入量为０１ｍＭ时，对该菌株固氮酶活 力影响不大，当增大到０５ｍＭ时则明显抑制了固氮酶活性，到１０ｍＭ时则完全抑制了该菌的 固氮活性。２４氧分压对固氮酶活性的影响Ｃｅｌ５１７菌株经诱导培养后，用反口橡皮塞封口 ，注入含有不同比例的混合气体，在反应４ｄ后，测定固氮酶活性（图２）。结果表明，氧分压为 １０％～２５％时固氮酶活性最高。２５泡囊诱导时间及反应方式对Ｃｅｌ菌株固氮酶活性的影 响Ｃｅｌ５１７菌株接入无氮限定培养液后，分别在诱导３，５，８，１１及１５ｄ后换塞，抽真 空注入混合气体在转床上反应５ｄ后，测固氮酶活性（图３）。结果表明，泡囊诱导时间对固氮酶 活性影响较大，该菌以５ｄ为宜，５ｄ以后固氮酶活性迅速下降。所以控制好诱导时间对获得较高 的固氮酶活力也是一个关键因素。图２氧分压对Ｃｅｌ５１７菌株固氮酶活性的影响图３泡囊诱导 时间对菌株固氮酶活性的影响此外还比较了振荡与静止两种方式对固氮酶活性的影响。结果，静止时固氮酶活性为２７０ｎｍｏｌＣ２Ｈ４／ｍｇ·蛋白质，还不及振荡时固氮酶活性的１／２。这说明选择振荡方式进行反应同样是获得高固氮活性的手段之一。弗兰克氏菌Cel 517菌株固氮研究@郝家骐@朱世琴@周鸿宾@魏玉芬@苏小芳$山西省生物研究所Ｆｒａｎｋｉ ａ,固氮由木麻黄（ＣａｓｕａｒｉｎａｅｇｕｉｓｅｔｉｆｏｌｉａＬ）根瘤中分离的内生菌Ｆ ｒａｎｋｉａｓｐＣｅｌ５１７菌株，可在以丙酸为碳源的限定培养基中表现出较高的固氮酶活性 。固氮周期在１８０ｈ达到高峰。蛋白胨与ＮＨ４Ｃｌ对固氮活性有抑制作用，氧分压为１０％～ １５％时，固氮酶活性最高，泡囊的诱导时间对固氮酶活性影响较大。１ＣａｌａｈａｍＤｅｔａ ｌ．Ｖｅｓｉｃｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄａｃｅｔｙｌｅｎｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎａｃｔｉ ｖｉｔｙｉｎＦｒａｎｋｉａｓｐＣＰ１１ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｄｅｆｉｎｅｄｎｕｔｒｉｅｎ ｔｍａｄｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７８，１９９：８９９～９２０２袁长芳，周鸿宾，郝家骐 等．一株木麻黄根瘤内生长培养条件的研究．微生物学通报，１９８６，１３（６），２４４～２ ４８３周鸿宾，郝家骐，袁长芳等．与某些非豆科植物共生的弗兰克氏菌的泡囊及其固氮作用的研 究．植物生理学报，１９８５，１１（３）：３１５～３１８└鲋蟹掷氲哪谏疲颍幔睿耄椋 幔螅穑茫澹欤担保肪辏稍谝员嵛荚吹南薅ㄅ嘌斜硐殖鼋细叩墓痰富钚浴９痰芷谠 冢保福埃璐锏礁叻濉５鞍纂擞耄危龋矗茫於怨痰钚杂幸种谱饔茫醴盅刮保埃ァ保担ナ保 痰富钚宰罡撸菽业挠盏际奔涠怨痰富钚杂跋旖洗蟆＃保茫幔欤幔瑁幔恚模澹簦幔欤郑澹螅 椋悖欤澹妫铮颍恚幔簦椋铮睿幔睿洌幔悖澹簦欤澹睿澹颍澹洌酰悖簦椋铮睿幔悖簦椋觯椋簦椋 睿疲颍幔睿耄椋幔螅穑茫校保保悖酰欤簦酰颍澹洌椋睿洌澹妫椋睿澹洌睿酰簦颍椋澹睿簦恚幔洌椋 幔樱悖椋澹睿悖澹保梗罚福保梗梗海福梗埂梗玻埃苍し迹芎璞觯录益氲龋恢昴韭 榛聘瞿谏づ嘌跫难芯浚⑸镅ūǎ保梗福叮保常ǎ叮玻矗础玻矗福持芎璞 觯录益耄し嫉龋肽承┓嵌箍浦参锕采母ダ伎耸暇呐菽壹捌涔痰饔玫难芯浚参锷硌Пǎ保梗福担保保ǎ常海常保怠常保
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