自从１９７６年Ｄｏｂｅｒｅｉｎｅｒ等提出联合共生固氮的概念以来，对芽孢杆菌固氮作用的研究 与开发已引起国外学者的重视［１］．迄今，已发现能固氮的芽孢杆菌有３种：多粘芽孢杆菌（Ｂ ａｃｉｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ）、浸麻芽孢杆菌，（Ｂ．ｍａｃｅｒａｎｓ）和固氮芽孢杆菌（ Ｂ．ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ）［２，３］．已在小麦、甘蔗、高梁和谷子等农作物根系发现了这 几种芽孢杆菌［１］，并证实了多粘芽孢杆菌能促进小麦、黑麦和白三叶草等植物的生长［４］． 芽孢杆菌能形成芽孢而具有其它细菌不可比似的优越性，因此，研究这一类细菌的联合固氮作用具 有重要意义．但目前对联合固氮作用的研究主要集中在对固氮螺菌的研究上，对芽孢杆菌的研究报 道仍较少，国内尚未见对这一类细菌固氮作用研究的报道．为了探讨我国土壤中作物根际联合固氮 芽孢杆菌的分布及其作用，筛选有应用价值的菌株，我们开展了根际联合固氮芽孢杆菌的研究，已 从６种农作物８８个根系样品中分离出５１株联合固氮芽孢杆菌，经鉴定均为多粘芽孢杆菌［５］ ．在根际联合固氮的芽孢杆菌中，分布最广泛的是多粘芽孢杆菌，该菌是一种兼性厌氧菌．目前， 国外文献报道中一般认为多粘芽孢杆菌是在厌氧条件下固氮［２，６，７］，而我们研究发现，５ １株多粘芽孢杆菌中，半数以上能在有氧条件下固氮（具有乙炔还原活性）．本文报道从作物根际 分离的多粘芽孢杆菌固氮作用的研究结果．１材料与方法１．１菌株参考菌株：多粘芽孢杆菌模式 菌株ＤＳＭ３６，浸麻芽孢杆菌模式菌株ＤＳＭ２４，固氮芽孢杆菌模式菌株ＡＴＣＣ４５１３， 均由中国典型培养物保藏中心（ＣＣＴＣＣ）提供．试验菌株：多粘芽孢杆菌５１株，系从武汉和 宜昌地区不同作物根系中分离得到．１．２培养基（１）保藏及传代培养基：Ｈｉｎｏ无氮培养基 斜面［６］，补加０．０８％酵母膏．（２）培养及测试用培养基：Ｈｉｎｏ无氮培养基基础上， 补加０．０８％酵母膏和０．１７％琼脂．培养瓶用２６ｍＬ容积的疫苗瓶，内装培养基８ｍＬ． 以上培养基均于１２１．３℃灭菌２０ｍｉｎ，备用．１．３培养方法将保存的多粘芽孢杆菌各菌 株斜面培养物转种Ｈｉｎｏ无氮培养基斜面，３５℃培养３６ｈ后再转种于装有培养基的疫苗瓶中 ，棉塞封口，３５℃培养３６ｈ后进行固氮酶活性测定．在测定不同氧浓度对固氮酶活性的影响时 ，则按上述方法转种于疫苗瓶培养基中，换上胶塞，抽真空，按不同比例充入氧气和氮气，３５℃ 培养３６ｈ后进行固氮酶活性测定．１．４固氮酶活性测定采用乙炔还原法［３，６］：各菌株培 养后将疫苗瓶换上胶塞，用无菌注射器换入１／１０体积乙炔（１．８ｍＬ），于３５℃处理６ｈ 后进行乙烯－乙炔含量测定．用日立１６３气相色谱仪测量产生乙烯的峰高，根据标准乙烯，计算 乙烯产生速率．２结果２．１在有氧条件下分离菌株固氮能力的测定将５１个分离菌株和３个参考 菌株在有氧条件下培养后测试其乙炔还原活性，结果具有乙炔还原活性的为２８株，占全部分离菌 株的５５％（表１）．从表１看出，在分离菌株中，ＨＷ－１菌株固氮酶活性最高，与国外文献报 道的结果比较［３，６］，其固氮能力是比较强的，因此本文进一步研究了培养条件对ＨＷ－１菌 株固氮活性的影响．２．２有氧条件下ＨＷ┐１菌株固氮活性的研究２．２．１培养过程中固氮活 性的变化ＨＷ－１菌株在不同培养时间的固氮活性变化见图１．从图１看出，延缓期固氮活性较低 ，对数生长期菌体迅速增殖，固氮活性大幅度提高，对数生长后期（３６ｈ）固氮活性达最高值， 静止期菌体增殖减慢，代谢能力降低，固氮活性也随之下降．２．２．２培养温度对固氮活性的影 响培养温度对ＨＷ－１菌株的固氮活性影响较大．从图２看出，ＨＷ－１菌株在３５℃培养时活性 最高，低于２８℃或高于３７℃固氮活性明显受抑制（图２）．表１部分分离菌株及参考菌株的固 氮活性菌株号乙炔还原值１）菌株号乙炔还原值１）ＷＤ－１１４．５ＳＷ－３１．６ＷＤ－２５ ．８ＳＷ－８０．８ＷＤ－５１．６ＷＷ－１２１．８ＷＤ－６２７．０ＹＧ－５０．６ＷＤ－７ １．２ＹＷ－４０．６ＷＤ－９７．５ＹＷ－６１１８．７ＷＤ－１２０．８ＹＷ－６２１８．７ ＷＨ－１２２５．３ＹＷ－７７．０ＷＨ－１８２．１ＹＸ－１０．４ＷＨ－１９４２．８ＹＸ－ ４３３．６ＨＷ－１７８．３ＹＸ－７１９．９ＨＷ－２１４．２ＹＸ－９０．７ＨＷ－３０．９ ＤＳＭ３６２．２ＨＲ－５１．３ＤＳＭ２４３５．３ＲＷ－４４１．９ＡＴＣＣ４５１３１２８ ．８ＳＷ－１３７．９１）乙炔还原值／１０－６ｍｏｌＬ－１ｈ－１２．２．３培养基ｐＨ值对 固氮活性的影响从图３看出，在培养基起始ｐＨ值为８．０条件下培养该菌，其固氮酶活性达到最 高值．２．２．４氧气浓度对固氮酶合成及活性的影响图４：ａ表示在培养起始加入不同浓度氧对 ＨＷ－１菌株乙炔还原活性的影响，在含５％Ｏ２条件下培养时其固氮酶活性最高，明显高于无氧 培养时的固氮酶活性，而随着Ｏ２浓度增高其固氮酶活性下降，但氧气浓度达到５０％仍然能测出 其活性．图１培养过程中固氮活性的变化ａ．生长曲线ｂ．固氮酶活性图２温度对固氮活性的影响 图４：ｂ表示在固氮酶活性测试系统中不同氧浓度对其固氮酶活性的影响，该菌株在无氧条件下固 氮酶活性最高，随着氧分压的增加，固氮酶活性逐渐降低．２．２．５ＮＨ＋４浓度对固氮酶合成 及活性的影响图５：ａ表示ＨＷ－１菌株在ＮＨ＋４存在条件下培养时随着培养基ＮＨ＋４浓度的 增加，固氮活性迅速下降，当ＮＨ＋４浓度达到２０ｍｍｏｌＬ－１时，固氮活性完全丧失．说明 在培养过程中ＮＨ＋４阻遏了固氮酶的合成．而图５：ｂ是在无ＮＨ＋４下培养３６ｈ后加入ＮＨ ＋４测其固氮活性，结果表示无明显变化，说明ＮＨ＋４对已合成的固氮酶的活性无抑制作用，即 不存在氨关闭现象．图３ｐＨ对固氮活性的影响３讨论多粘芽孢杆菌是一种兼性厌氧细菌，长期以 来，国外文献报道的研究结果认为该菌在厌氧条件下固氮，１％氧存在下固氮活性几乎完全被抑制 ［１，６］，《伯杰氏系统细菌学手册》也明确指出该菌在厌氧条件下固氮［７］．虽然Ｍｏｏｒ ｅ在本世纪６０年代曾报道了运用凯氏定氮法从尼日利亚土壤中分离的多粘芽孢杆菌能在有氧条件 下固氮［８］，但是，自从应用乙炔还原法测定固氮酶活性以来，研究多粘芽孢杆菌的报道大多沿 用Ｓｅｌｄｉｎ等人的方法，从培养到固氮酶活性测试均在厌氧条件下进行［６］．而我们对从我 国土壤作物根际分离的多粘芽孢杆菌的研究结果表明，半数以上的分离菌株在有氧条件下具有乙炔 还原活性，模式菌株也有微弱的乙炔还原活性．这说明多粘芽孢杆菌不仅能在厌氧条件下合成固氮 酶并固氮，还能在有氧条件下合成固氮酶并固氮．此结果图４Ｏ２浓度对固氮酶活性的影响ａ．培 养开始注入０～５０％Ｏ２ｂ．无氧培养，乙炔还原系统加入０～５０％Ｏ２图５ＮＨ＋４浓度对 固氮酶合成及活性的影响ａ．培养基中加ＮＨ＋４ｂ．乙炔还原体系中加ＮＨ＋４表明多粘芽孢杆 菌存在避氧机制．据ＨＷ－１菌株固氮特性结果推测，在培养起始阶段细菌需要足够氧气（最适５ ％）来进行菌体增殖，然后菌体可能通过呼吸作用或其它作用造成胞内无氧环境以利于合成固氮酶 ，当加入氧气量超过避氧平衡阈值时则阻遏其合成．而氧气对已合成的固氮酶的活性产生抑制，即 存在氧关闭现象，这与许多固氮微生物相似．但是，在培养起始和测试系统中加入氧气量至５０％ 仍能测到乙炔还原值，说明该菌的避氧保护能力相当强，由此推测该菌或许还存在其它的避氧机制 ．关于ＨＷ－１菌株的避氧保护机制尚待进一步研究．通过乙炔还原法测定所得结论与Ｈｉｎｏ及 Ｓｅｌｄｉｎ等人有关多粘芽孢杆菌在厌氧条件下固氮的结论［２，６，７］相矛盾，而支持了Ｍ ｏｏｒｅ的观点［８］．从作物根际分离的多粘芽孢杆菌固氮作用的研究@张高峡@卢振祖$武汉 大学生命科学学院多粘芽孢杆菌，固氮作用，乙炔还原用乙炔还原法，研究了从作物根际分离的５ １株多粘芽孢杆菌的固氮作用，结果表明：２８株在有氧条件下培养能合成固氮酶并固氮，其中Ｈ Ｗ－１菌株固氮酶活性达７８．３×１０－６ｍｏｌＬ－１ｈ－１．该菌株固氮活性在对数生长后 期（３６ｈ）最高，最适固氮培养条件是３５℃和ｐＨ８．０．该菌株在有５％氧气的条件下培养 时，固氮活性最高，在初始培养和乙炔还原体系中分别注入５０％氧气仍能检测到乙炔还原活性． 培养基中ＮＨ＋４阻遏该菌株固氮酶合成，但对已合成的固氮酶活性无影响．１ＶｏｓｅＰＢ．Ｄ ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎｎｏｎｌｅｇｕｍｅＮ２－ｆｉｘｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓ．ＣａｎＪ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８３，２９：８３７～８５０２ＨｉｎｏＳ，ＷｉｌｓｏｎＰＷ．Ｎｉ ｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘａｔｉｏｎｂｙａｆａｃｕｌ－ｔａｔｉｖｅＢａｃｉｌｕｓ．ＪＢａｃｔ ｅｒｉｏｌ，１９５８，７５：４０５～４０８３ＳｅｌｄｉｎＬ，ＥｌｓａｓＪＤＶ，Ｐｅｎｉ ｄｏＥＧＣ．Ｂａｃｉｌｕｓａ－ｚｏｔｏｆｉｘａｎｓｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎｉｔｒｏｇｅｎ－ ｆｉｘｉｎｇｓｐｅｃｉｅｓｆｒｏｍＢｒａｚｉｌｉａｎｓｏｉｌｓａｎｄｇｒａｓｓｒｏｏｔ ｓ．ＩｎｔＪＳｙｓｔＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８４，３４：４５１～４５６４ＨｏｌＦＢ，Ｃ ｈａｎｗａｙＣＰ，ＴｕｒｋｉｎｇｔｏｎＲ，ｅｔａｌ．Ｒｅ－ｓｐｏｎｓｅｏｆｃｒｅｓｔｅ ｄｗｈｅａｔｇｒａｓｓ（ＡｇｒｏｐｙｒｏｎｃｒｉｓｔａｔｕｍＬ．），ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｒｙｅｇｒａｓｓ（Ｌｏｌｉｕｍｐｅｒｅｎｎｅ）ａｎｄｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（Ｔｒｉｆｏ ｌｉｕｍｒｅｐｅｎｓＬ．）ｔｏｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈＢａｃｉｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ．ＳｏｉｌＢｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９８８，２０：１９～２４５张高峡，卢振祖．作物根际联合固氮芽孢杆菌的分离鉴定及生态分布．氨基酸和生物资源，１９９８，２０（１）：１２～１５６ＳｅｌｄｉｎＬ，ＥｌｓａｓＪＤＶ，ＰｅｎｉｄｏＥＧＣ，ｅｔａｌ．Ｂａｃｉｌ－ｌ
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