大量的研究结果表明，在甘蔗、玉米等禾本科植物的根际存在多种固氮微生物。由于这些存在于根际 的固氮菌与植物存在着相对的寄主专一性，因此７０年代巴西学者Ｄｏｂｅｒｅｉｎｅｒ提出了联 合固氮作用（Ａｓ－ｓｏｃｉａｔｉｖｅＮｉｔｒｏｇｅｎＦｉｘａｔｉｏｎ）的概念［１］。联 合固氮是介于自生固氮与共生固氮之间的类型。在联合固氮体系中，固氮菌聚居于植物根际、根表 ，甚至有一部分菌进入根内、根细胞中［２］，将固定的氮提供给植物，与相应联合的植物具有较 密切的相互关系。联合固氮的研究引起了日益广泛的关注，特别是联合固氮菌对作物的增产效应更 是成为人们关注的热点［３］。甘蔗是我国南方的重要经济作物之一，糖业生产已成为广西的经济 支柱产业。广西年种植甘蔗４０万ｈｍ２以上，甘蔗生产在广西农业生产中具有重要的地位。但是 广西土地贫瘠，含氮量不足，致使单产较低。施用高效甘蔗联合固氮菌将成为促进甘蔗增产的措施 之一［４，５］，因此筛选固氮酶活性高的甘蔗联合固氮菌，研究甘蔗联合固氮菌对甘蔗根组织的 固氮酶活性和叶中氮、磷、钾及微量元素的影响，对今后的联合固氮理论研究和甘蔗联合固氮菌的 应用具有十分重要的意义。１材料与方法１．１菌株和培养基实验所用的菌种：Ｐ４（美国菌种保 藏中心）、Ｐ５（美国菌种保藏中心）ＭＪ９７０１（广西宾阳台糖１０号）、ＭＪ９７０２（广 西宾阳台糖１０号）、ＭＪ９７０３（广西宾阳台糖１０号）、ＭＪ９７０４（广西宾阳台糖１０ 号）、ＭＪ９７０５（广西宾阳台糖１０号）、ＭＪ９７０６（广西柳城ＣＰ）、ＭＪ９７０７（ 广西柳城，台糖１６号）、ＭＪ９７０８（广西南宁，桂糖１６号）、ＭＪ９７０９（广西钦州， 桂糖１６号）。固氮菌基础培养基Ⅰ（固体）：２％葡萄糖，０．１％Ｋ２ＨＰＯ４，０．０２％ ＭｇＳＯ４，０．０５％ＣａＣＯ３，０．０２％Ｎａ－Ｃｌ，０．０００５％ＮａＭｏＯ４，１ ．５％琼脂，Ｈ２Ｏ１Ｌ，ｐＨ值７．２或ｐＨ值５．０；固氮菌基础培养基Ⅱ（液体）：０．０ ５％酵母膏，其它成分同培养基Ⅰ。培养温度为３０℃。１．２固氮酶活性分析将菌株接种于１０ ｍＬ液体的固氮基础培养基Ⅱ，于３０℃摇床振荡培养至３ｄ和７ｄ，分别取１ｍＬ于灭菌的５ｍ Ｌ小瓶中，盖上橡皮塞，瓶盖边缘以Ｐａｒａｆｉｌｍ封口。用注射器将１ｍＬ的乙炔注入其中， 于３０℃反应１ｈ，然后取４０μＬ反应气体，以岛津ＧＣ－９Ａ气谱检测乙烯含量后，以下列公 式计算固氮酶活性。固氮酶活性（ｎｍｏｌＣ２Ｈ４·ｍＬ菌液·ｍｉｎ）＝Ｋ·样品乙烯峰高（ ｍｍ）·反应瓶体积（μＬ）１％乙烯峰高（ｍｍ）·１％乙烯进样量（ｕＬ）·反应时间（ｍｉ ｎ）标准乙烯为１％，当进样１０μＬ时Ｋ＝４．２，当进样２０μＬ时Ｋ＝８．４，依此类推， 当进样４０μＬ时Ｋ＝３３．６。１．３接种甘蔗并测定根的固氮酶活性将菌种接种入固氮基础培 养基Ⅱ（液体）１００ｍＬ，３０℃，振荡培养５ｄ，将甘蔗组织培养小苗（二级苗）的根浸入菌 液，２０ｍｉｎ。取出小苗种于灭菌的沙瓶中，４５ｄ后取出，取１ｇ根于灭菌小瓶中，盖上橡皮 塞。盖边缘以Ｐａｒａｆｉｌｍ封口。测定固氮酶活性，方法同１．２。甘蔗品种为台糖２０号， 二级组织培养小苗。１．４甘蔗叶中氮、磷、钾及微量元素的测定将整株甘蔗苗的叶片剪下，烘干 剪碎。用凯氏定氮法测定氮的含量；用比色法测定磷的含量；用原子吸收法测定钾、钙及微量元素 。１．５数据处理所测数据进行显著性方差分析［６］。２结果与分析２．１固氮酶活性测定分别 以固氮基础培养基Ⅱ振荡培养３ｄ和７ｄ后，测得固氮酶活性（表１）。在培养３ｄ时，菌株ＭＪ ９７０１、ＭＪ９７０５、ＭＪ９７０６和ＭＪ９７０８的固氮酶活性比Ｐ４的高，Ｐ＜０．０１ ；ＭＪ９７０２、ＭＪ９７０９为无差异；ＭＪ９７０３、ＭＪ９７０４则比Ｐ４的低，分别是Ｐ ＜０．０１和Ｐ＜０．０５。在培养第７天时，除了ＭＪ９７０１比对照低（Ｐ＜０．０１）以外 ；其余菌株均比对照高（Ｐ＜０．０１）。从固氮酶活性和菌的生长量看，菌株ＭＪ９７０１生长 快，第３天显示出高生长量和高固氮酶活性，之后生长继续而固氮酶活性降低，认为该菌液受污染 或该菌仅生长前期有固氮酶活性，还需继续研究。其它菌株在第７天均表现出高固氮酶活性，且生 长量适中，其中菌株ＭＪ９７０５和ＭＪ９７０８固氮酶活性最高。表１菌株的固氮酶活性测定结 果Ｔａｂｌｅ１Ｔｈｅｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ菌 株Ｓｔｒａｉｎ７２ｈ１６８ｈＯＤ６００固氮酶活性Ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ ＯＤ６００固氮酶活性ＮｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙＰ４０．２９７４７．１２７１ ．０４６７９．７５１Ｐ５ＭＪ９７０１１．３８７１１３．０３７＊＊２．５２３２７．５９３ ＊＊ＭＪ９７０２０．７５７４０．９８０１．４０９１３６．６１９＊＊ＭＪ９７０３０．６５ ８１９．１８５＊＊１．３０１１３３．９２７＊＊ＭＪ９７０４０．７５０２８．００３＊１． ２２２１３１．９０８＊＊ＭＪ９７０５０．５４８１６７．３３５＊＊１．２３２１９０．１２ ３＊＊ＭＪ９７０６０．２９８１１９．５２５＊＊１．４４４１１７．７７５＊＊ＭＪ９７０７ ０．２５６３７．９０７ＭＪ９７０８０．５３２１０５．１８２＊＊１．３４７１６６．５６８ ＊＊ＭＪ９７０９固氮酶活性单位：ｎｍｏｌＣ２Ｈ４．ｍＬ菌株·ｍｉｎ；与Ｐ４相比较：＊Ｐ ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。Ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｕｎｉｔ：ｎｍｏｌ Ｃ２Ｈ４．ｍＬｃｕｌ－ｔｕｒａｌ．ｍｉｎｕｔｅ；ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｓｔｒａｉｎＰ ４，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。２．２固氮菌对甘蔗根的固氮酶活性的影响接种菌株后 ，甘蔗根的固氮酶活性测定结果见表２。相对于对照，只有接种Ｐ４、ＭＪ９７０３和ＭＪ９７０ ８菌株的甘蔗根固氮酶活性比对照的高（Ｐ＜０．０１）；接种ＭＪ９７０２、ＭＪ９７０４的甘 蔗根的固氮酶活性与对照无差异（Ｐ＞０．０５）；接种Ｐ４、ＭＪ９７０５、ＭＪ９７０６及Ｍ Ｊ９７０９菌株的甘蔗根固氮酶活性比对照的活性低，差异显著（０．０１＜Ｐ＜０．０５）。表 ２固氮菌对甘蔗根的固氮酶活性的影响Ｔａｂｌｅ２Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｚｏｔｏｂａｃｔｏｒｏ ｎｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｕｇ┐ａｒｃａｎｅｒｏｏｔ菌株Ｓｔｒａｉ ｎ固氮酶活性Ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ菌株Ｓｔｒａｉｎ固氮酶活性Ｎｉｔｒｏ ｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙＰ４１６９．３５９＊＊Ｐ５７５．１１９＊ＭＪ９７０１ＭＪ９ ７０２１０１．０６９ＭＪ９７０３１５０．２３８＊＊ＭＪ９７０４９２．１９２ＭＪ９７０５ ７９．２１６ＭＪ９７０６８０．５８２ＭＪ９７０７ＭＪ９７０８１５２．２８７＊＊ＭＪ９７ ０９６１．４６１ＣＫ１０１．０６９固氮酶活性单位：ｎｍｏｌＣ２Ｈ４．克根组织．分钟；与 对照（ＣＫ）相比较：＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。Ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅａｃｔｉｖ ｉｔｙｕｎｉｔ：ｎｍｏｌＣ２Ｈ４．ｇｒａｍｒｏｏｔ．ｍｉｎｕｔｅ；Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉ ｔｈＣＫ，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。２．３固氮菌对甘蔗叶中氮、磷、钾、钙和镁含 量的影响接种固氮菌菌株后测定甘蔗叶片中的氮、磷、钾、钙和镁的含量，结果见表３。在氮的含 量方面，ＭＪ９７０２、ＭＪ９７０３、ＭＪ９７０４、ＭＪ９７０５、ＭＪ９７０８和ＭＪ９７ ０９的含氮量高于对照，但无显著差异，以ＭＪ９７０８的含量最高；Ｐ４、Ｐ５和ＭＪ９７０６ 的含氮量与对照相当。接种固氮菌的甘蔗叶中磷、钾、钙和镁的含量与对照差异也不显著。表３甘 蔗叶片中氮、磷、钾、钙和镁的含量Ｔａｂｌｅ３Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，ｐｏｔａｓｓｉｕｍ，ｃａｌｃｉｕｍ，ｍａｇｎｅｓｉｕｍｏｆｓｕ ｇａｒｃａｎｅｌｅａｖｅｓ菌株Ｓｔｒａｉｎ元素含量Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｅｌｅｍｅ ｎｔｓ（ｍｇ／ｇＦＷ）ＮＰＫＣａＭｇＰ４１５．１１．７１２．５４．４１．２Ｐ５１５．５ １．９１７．１４．５１．０ＭＪ９７０１ＭＪ９７０２１７．６１．８１４．５５．５１．３Ｍ Ｊ９７０３１６．５１．６１５．５４．９１．５ＭＪ９７０４１７．４１．５１５．９４．３１ ．３ＭＪ９７０５１７．６１．４１６．０４．１０．９ＭＪ９７０６１５．３１．５１２．９４ ．７０．８ＭＪ９７０７ＭＪ９７０８１８．０１．８１４．８４．２１．２ＭＪ９７０９１６． １２．０１４．５４．７１．３ＣＫ１５．３１．６１４．０５．３１．０２．４固氮菌对甘蔗叶 中微量元素含量的影响接种固氮菌菌株后测定甘蔗叶片中的铜、铁、锰和锌的含量，结果见表４。 接种固氮菌的甘蔗叶中铜、铁和锌的含量与对照无显著差异，但锰的含量则均比对照的高（Ｐ＜０ ．０１）。表４甘蔗叶片中微量元素的含量Ｔａｂｌｅ４Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｍｉｃｒｏ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓｏｆｓｕｇａｒｃａｎｅｌｅａｖｅｓ菌株Ｓｔｒａｉｎ元素含量Ｔｈｅｃｏ ｎｔｅｎｔｓｏｆｅｌｅｍｅｎｔｓ（μｇ／ｇＦＷ）ＣｕＦｅＭｎＺｎＰ４２．６３７９．７９ １３９．４１＊＊２５．４３Ｐ５４．９３９３．１６１０９．２８＊＊２４．６３ＭＪ９７０１ ＭＪ９７０２３．４６７７．０７５０．２３＊＊１９．９２ＭＪ９７０３３．８９９９．４９９ ８．１９＊＊１９．９０ＭＪ９７０４３．４７６２．０５９３．７３＊＊１７．３６ＭＪ９７０ ５２．６０１１０．９９６５．４７＊＊１８．６４ＭＪ９７０６３．４９８５．６４６６．０８＊＊２３．０４ＭＪ９７０７ＭＪ９７０８３．９３８６．４２７２．９０＊＊２１．８３ＭＪ９７０９３．９０８８．４６１０２．７７＊＊２４．７１ＣＫ３．９０１０７．１４３１．９７２４．１９＊＊与对照（ＣＫ）相比，＊Ｐ＜０．０１。ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣＫ，＊Ｐ＜０
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