自然界中,形形色色的生物之间的差异是由其遗传物质D执A决定的。尽管生物能复制自己的DNA ,但有许多初.制如突变、倒位、缺夫、重排等都会引起DNA的变化,_农现华DNA的多态性 。任何生物或个体都拜有特定的D河A多态性。DNA分子诊断技术就是通过直接分析遗传物质的 多态性来诊断生物内在基因的排布规律及其外在性状的表现规津。它突破了儿乎所有生初由于依赖 于形态性状等表现型的分析而受到的生物内外环境因素影响的局限性,从分子水平上快速准确地测 定DNA的差异,因而在短短几十年的发展过程中,在许多领域如遗传育种、起源进化、分类、医学等领域已展示出其广阔的应用前景。DNA分子诊断技术的种类DNA分于诊断技术。DAF‘DNAAmplifiedF:nger-p‘i“tlT‘g,Caetano一Anolles G.等19,zt‘1)是以大于或等于5个碱甚的随机引物扩增不同个体DNA分子,然后进行聚 丙烯酞胺凝胶电泳和;银逛分析,产生更多的多态性。AS一PCR(A>}。l。一SpeeificPCR,wU DY等,1,89乙协利用一对等匹基乙特异性的寡聚核普酸引物进行该等位基因差异的个体DNA 的PcR扩增,然尼进行琼脂糖蕃胶电泳分析。SCARS(S二(.onc。Choroeterizedan,plifi。(l:、·91。、P。二am and Mie卜‘。1-。1o。,199少J)是对特笋且、PD条带进行克隆并测序,并以此测出序列 的末端14b姜〕加上原来RAPD所用的IObp的引物合成出别bp的寡聚核步酸引物,然后用表l几种代表性分子诊断技术比较 DNA分子诊断技术大致可分为两类:一类是以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子诊断技术,如RFLP(Restrietion Fragme,飞t IJength Polymorphism)技术,DNA指纹(DNA Fingerpri,lting)技术等。这类技术的共同特点是利用一种或儿种限制性内切酶硝 化不同生物个体的DNA分子,通过特异性的克隆或合成的探针进行分子杂交来揭示其DNA的多态性。另一类是以DNA扩增技术和电泳技术为核心的分子诊断技术.如RAPD(RandomAmplified polymorphicDNA)技术、CAPS(Cleaved Atnplified PolymorphieSeq。enc。)技术等,这类技术的共同特点是利用合成的随机引物, 通过PCR扩增不同生物个体的DNA分子,然后进行电泳来揭示其DNA的多态性。现将儿种有代表性的分子诊断技术对比如下(见表l)。另外,以PCR技术为基础,还发展出诸如DAF、AS一PCR、SSARS、SSCP一PCR、RAPD一I兀GE等技术创立者 RF乞PD又A指纹技术RAPDGrod,i‘ker等l一,Jeffroy等;一2卿111,。rn攀CAPS,JAI:叩W行ly哥一n:一‘l火!、和年代核心技术 1985电泳技术分子杂交多态性姚,甲高类型多态性水平DNA用量DN人纯度技术难度可靠性遗传性 1974 电泳技术 分子杂交单碱基突变缺失、易位倒位、插入 中 2一10厂g 较纯 中 高简单孟德尔 方式 德定 单一序列重复序扮!长度重复次数空异50一10t)ng简单孟德尔方式稳定探针或引物重复序列类型探针探针 入Ic‘)ellandt4) !99()1 992 电冰技术电泳技术PCR技术PCR技术单碱葵空变单碱基突变缺失、易位缺失、易位倒位、播入倒位、插入 中中10一弓t)ng 50一1介ong 粗较纯 低中 中高简单孟德尔简单孟德尔 方式方式 稳定稳定9一lobp寡取核昔酸 随机引物引物25种子Seed 1997年第s期(总第59期)此引物进行基因组扩增分析。这一技术指出了RAPD技术的分子 基础。而且,一些由于缺失或插入引起的DNA多态性,难以用RAPD分析,但可以被SCAP S揭示。此外.该技术能将RAPD的显性标记转变为共显性标记,从而提高遗传标记的效率。SSCP(Single一strandeo耐ormational Polymorphism,Orital,1989<,〕)是单链构型多态性技术。根据某一散 布重复序列(即散布在染色体的不同位点上的重复序列)设计出特异引物进行PCR扩增,然后将 扩增的DNA片段变性,在非变性的聚丙烯酸胺凝胶上电泳,则将单链DNA按分子构型的差异( 二级和三级结构差异)区分开来,从而揭示每个位点的该重复序列的多态性。RAPD一DGGE(RAPD一众naturinggradient geleleetrophoresis,Myers,1957<,0」)是随机扩增多态性变性 梯度凝胶电泳技术。这种技术可以分辨出相同或相似大小的片段差异性,甚至可以检测出DNA片段的单碱基对差异。2DNA分子诊断技术的分子生物学基础 DNA分子诊断技术是建立在DNA分子的多态性(Polymorphism,diversity or fingerprinting)的基础之上,而DNA的多态性是指DNA碱基顺序的差异性,这种差异可分为以下三种类型:2.1单碱基突变 DNA在某一特定序列上有一个或几个单碱基发生点突变,如果这种突变恰好发生在限制性酶酶切位点上,则产生DNA酶切片段多态性,即 RFLP(s)。如果这种突变恰好发生在PCR引物退火位置,并导致引物不能与DNA单链配对 ,从而不能扩增出所需片段,这样所显示的酶切片段多态性即RAPD(s)。如果这种突变发生 在PCR扩增的片段内,则扩增产物分子量或熔解温度(Tm)之间的差异可被电泳检测出来。2.2多碱基序列突变DNA在某一段序列上因缺失、插入、易位、倒位等产生差异,这些差异不仅可能会导致酶切位点丢 失或增加,而且也能改变两个酶切位点间酶切片段的长度,出现RFLP(s)。如果这些变异发 生在引物退火位置,或引物延伸区域,则导致PCR产物增加或减少,出现RAPD多态性。2.3串联重复序列在真核生物基因组中,除了单拷贝序列,还有许多重复序列。这些重复序列既可能存在于DNA编码 区内,也可存在于非编码区内;或是散布于基因组多处,或成为串联重复。目前,被广泛用于DNA指纹分析的·26·重复序列主要是位于非编码区的小卫星序列和微卫星序列。小卫星DNA(mini一sa tellite)是指重复单位长度为n一6Obp,总长度由几百个碱基到几千碱基组成的串联 重复序列,分布于整个基因组中,但主要存在于近端粒处。微卫星DNA(n、ierosate llite)是由一些重复单位长度为1一sbp组成的长达几十个核昔酸的短串联重复序列,其 分布特点类似于小卫星DNA,由于不同生物个体间存在着串联重复序列数目的差异,因而可进行多态性分析〔’川’」。3DNA分子诊断技术在品种纯度检验 上的应用 种子是种植业中最基本的生产资料,这些产业的成败在很大程度上取决于用于播种的种子质量,而种 性纯度是种子质量控制中最棘手的问题,包括品种真实性和纯度。种子科学与技术的不断发展.积 累了许多已应用于实际工作中的室内鉴定方法,如形态法、化学法以及电泳技术。但是,近代育种 者为了在短时间内培育出高产稳产品系,以顺利通过区域试验和品种审定,往往集中利用为数不多 的骨干亲本澎自交系.这在客观_L缩小了品种间形态方面的差异,使可用于品种鉴定的形态特征 性状数目有限;而且,多数形态性状易受环境因素的影响,故仅靠简单的形态特征来鉴别品种非常 困难,且准确率较低。种子储藏蛋白质和同工酶是基因表达的产物、不受环境的影响。利用不同品 种的分子储藏蛋白质和同工酶电泳的特征谱带的差别进行相互鉴别对品种纯度检验的快速、准确和 实用起到了很大的作用。但是,应用同工酶在鉴定品种真实性和纯度时,往往有组织或器官特异性 ,而且由于育种者愈加重视种子蛋白类型的选择,使得亲缘关系密切的品种的种子储藏蛋白或同工 酶难以通过电泳加以区分。现在品种纯度检定直接可靠的方法是田间小区种植检验,但多采用易地鉴定,时间长且费工占地.DNA分子诊断技术同样无环境效应和基因多效性。但相比之下却有其独到之处:①植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析; ②每一位点总存在多态性,遗传稳定,既能探索品种间染色体组孟德尔遗传因子方面的差异,又能揭示母体细胞质方面的非孟德尔遗传因子的影响; ③由于探针数目与内切酶种类组合方式在理论上不可计数,因而其潜在的鉴别能力是不可估量的; ④直接测定基因的核普酸组成,无论有无编码作用的DNA序列以及DNA的重复序列,均可被探针显种子Seed 1997年第3期(总第89期)示出来,非常灵敏、准确; 遏少分离出的样品DNA在适宜条件下可长期保存,这对于进行追朔性或仲裁性鉴定是非常有利的。另外也可以从标准对照品种制备大量DNA,以供长期使用。 目前,DNA分子诊断技术已开始被用于品种真实性及纯度检验中。Barr等(2983<,3〕 )应用28个随机拷贝。DN入探针和3种内切酶,研究了6个玉米自交系DNA片段的变异,结 果16个探针有多态性,而且每个色往包括多个等位基因变异体.虽然这些自交系的同二L酶差异 极大,但同工酶变异个体数目远远少于DNA片段的变异。据Gale等(1985{‘,1)报道,以Hind111内切酶消化小麦DNA,并以叶子CDNA作探针杂交,在24个品种中有13个品种具有特 征片段图谱。余四斌等(1996<,’少)从三叶期前后的水稻幼叶中提取DNA,采用RAP D技术鉴定杂交水稻种子纯度,认为选用的巧个弓{物中AD。魂的鉴别效果最好。用ADO。对 珍汕盯B(50株、和明恢63(50株)进行RAPD分析表明,扩增产物在各亲本内是完全一致的,两亲本间存在明显鳌异,该差异与标准样品的差异是完全相同的,这一方面说明亲本无混杂,另
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