固氮花生根瘤菌ＨＮ１４的构建朱光富，周俊初（武汉华中农业大学部级农业微生物重点开放性实验 室，４３００７０）摘要利用三亲本杂交，将带有肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕ ｍｏｎｉａｅ）ｎｉｆＡ基因的重组质粒ｐＣＫ３导入慢生型花生根瘤菌［Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏ ｂｉｕｍｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）］１４７－３，初筛获得的转移接合子ＨＮ１４。其在盆栽试 验中的共生固氮效率明显优于出发菌株１４７－３。关键词花生根瘤菌；转移接合子；共生固氮效 率中图法分类号Ｑ７５将外源共生质粒通过接合转移导入花生根瘤菌以提高竞争结瘤能力和共生固 氮效率的例子少见报道。Ｐａｎｋｈｕｒｓｔ［１］，Ｔｒｉｎｉｃｋ［２］和Ｋｏｎｄｏｒｏｓ ｉ［３］等将苜蓿根瘤菌Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ的共生质粒ｐＲｍｅ４ｌｂ、ｐＡ Ｋ１１和ｐＡＫ１２导入花生根瘤菌ＰＮ４０３３和ＭＰＩＫ３０３０（即ＮＧＲ２３４）中，转 移接合子虽然能够在苜蓿根上形成大小不一的根瘤，但只能发育至一定的阶段，而且没有固氨酶活 性。ｓａｎｊｕａｎ和Ｏｌｉｖａｒｅｓ［４］将ＰＣＫ３质粒（其上携带Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ的ｎｉｆＡ基因）分别引入苜蓿根瘤菌２０ｌｌ的固氮调节基因发生了突变 的ＮｔｒＡ－、ＮｔｒＣ－和ＮｉｆＡ－等３个菌株中，发现转移接合子的竞争结瘤能力均高于各 自的亲本菌株，但只有ＮｉｆＡ－转移接合子的竞争结瘤能力恢复到了野生型水平。为了进一步研 究Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ的ｎｉｆＡ基因对根瘤菌竞争结瘤能力的影响，他们将质粒ｐＣＫ３ 又引入到４株野生型的苜蓿根瘤菌中，发现转移接合子的固氮酶活性没有改变。但竞争结瘤能力都 比各自亲本大幅度提高。本研究利用三亲本杂交方法将克隆有Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｐｉａｅ的ｎｉｆ Ａ基因的外源重组质粒ｐＣＫ３导入慢生型花生根瘤菌１４７－３中，盆栽试验结果表明，转移接 合子ＨＮ１４的共生固氮效率明显优于出发菌株１４７－３。１材料与方法１．１供试菌株和培养 条件１）供试菌株和质粒（见表１）。２）培养条件。根瘤菌培养：液体培养采用ＹＧＡ（将ＹＭ Ａ中的甘露醇１０ｇ改为甘油１０ｍｌ），固体培养采用ＳＭ或ＹＧＡ。培养温度为２８℃。大肠 杆菌培养：采用ＬＢ培养基。培养温度为３７℃。抗生素使用浓度：四环素（Ｔｃ）为１００μｇ ／ｍｌ；卡那霉素（Ｋｍ）为５０μｇ／ｍｌ。１．２实验方法接合转移，采用滤膜三亲本杂交法 ［７］。质粒检测，大肠杆菌质粒采用修改后的碱变性法［８］提取，根瘤菌质粒采用Ｈｉｒｓｃ ｈ碱变性国家“８６３”高技术研究发展计划资助课题朱光富、男，１９６６年生，硕士，现在工 作单位：广东省佛山市动植物检疫局，佛山５２８３００质粒检测，大肠杆菌质粒采用修改后的碱 变性法［８］提取，根瘤菌质粒采用Ｈｉｓｃｈ碱变性法［９］提取。ＴＥ溶解后，一起点样电泳 。花生植物结瘤试验，采用周平贞的水培法［１０］。根瘤固氮酶活性测定采用乙炔还原法。植物 地上部分含氮量的测定采用半微量凯氏定氮法。２结果２．１外源重组质粒ｐＣＫ３向１４７－３ 的转移选取ＳＭ＋Ｔｃ（１００μｇ／ｍｌ）培养基筛选转移接合子，并以ＳＭ作为受体菌计数平 板。由于１４７－３对Ｔｃ敏感，ＨＢ１０１和ＭＭ２９４均为营养缺陷型，因而通过ＳＭ＋Ｔｃ 选择平板可淘汰受体菌１４７－３，供体菌ＨＢ１０１和辅助菌ＭＭ２９４而只让转移接合子生长 。在选择平板ＳＭ＋Ｔｃ上获得４．１２×１０４个菌落，计数平板ＳＭ上获得２．５３×ｌ０８ 个菌落，由此计算出质粒ｐＣＫ３的转移频率为１．６３×１０－４，同时测定的１４７－３的Ｔ ｃｒ自发突变频率小于１０－８。２．２转移接合子ＨＮ１４中外源质粒的鉴定随机挑取经ＳＭ＋ Ｔｃ（１００μｇ／ｍｌ）平板纯化的转移接合子并编号为ＨＮ１４，用修改的碱变性法提取质粒 ，电泳检测结果如图１。２．３转移接合子ＨＮ１４的Ｔｃ抗性在人工条件下的稳定性将转移接合 子ＮＮ１４在不加抗生素的ＹＧＡ平板上转接２次，然后作系列稀释，倒平板培养获得单菌落，再 随机挑取１００个单菌落分别点种于ＹＧＡ＋Ｔｃ（１００μｇ／ｍｌ）和ＹＧＡ平板上，结果表 明只有８０％的转移接合子仍具有四环素抗性，丢失率为２０％（图２）。２．４转移接合子ＨＮ １４的植物盆栽结瘤试验和共生固氮效率将经表面灭菌并催芽至２～４ｃｍ的花生种子播于已灭菌 的水培瓶上，同时接种根瘤菌悬液１ｍｌ，在光照棚于自然光照下培养约４０ｄ，取回观察测定。 观察项目包括植株高度、瘤数、瘤重、地上部分植株干重、根瘤固氮酶活性、地上部分植株含氮量 和植物总氮量等。结果见表２。转移接合子ＨＮ１４在株高、叶色和生长势等方面明显优于受体菌 １４７－３（图３）。从表２可以看出，ｐＣＫ３导入１４７－３后，转移接合子ＨＮ１４在花生 上所结根瘤瘤重较出发菌株１４７－３增加６０％、地上部分干重增力４４．６％、地上部分含氮 量增加２０．２％，地上部分总氮量增加８５．Ｏ％，且均达到显著水平（ａ＝０．０５）。株高 、根瘤数和固氮酶活性也较出发菌株１４７－３分别增加１２．７％、４３．９％和２０．９％， 但未达到显著水准。２．５转移接合子在共生条件下抗性稳定性测定从接种转移接合子ＨＮ１４的 花生根瘤中分离出单菌落，随机挑取１００个分别点种ＹＧＡ＋Ｔｃ和ＹＧＡ平板，结果表明９ｌ 个单菌落具有Ｔｃ抗性，但仍有９个丢失了Ｔｃ抗性，丢失率为９％，检测结果表明没有Ｔｃ抗性 的菌落均系外源质粒ｐＣＫ３丢失所致。这说明转移接合子在共生条件下仍有不稳定性现象，但其 丢失率在人工条件下相对较低。３讨论将外源共生基因引入野生型受体根瘤菌，增加某些基因的拷 贝数或导入新的基因，以期筛选共生性状发生改变的杂交组合，已成为根瘤菌遗传育种手段之一。 ＤｅＪｏｎｇ等［１１］将豌豆根瘤菌１２８Ｃ５３的共生质粒ｐＩＪ１００８引入到豌豆根瘤菌 ３００及３６２２中，得到的转移接合子的结瘤固氮能力显著高于各自亲本菌株，其中ｐＩＪ１０ ０８引入菌株３００之后，导致接种植物的干重增加１５％，固氮量增加３０％。张学贤等［１２ ］将豌豆根瘤菌的共生质粒ｐＪＢ５ＪＩ导入Ｒ．ｈｕａｋｕｉｉ７６５３Ｒ及Ｒ．ｆｒｅｄｉｉ Ｂ５２中，所得到的转移接合子在固氮酶活性、地上部分干重及竞争结瘤能力方面都较各自亲本显 著提高。这些工作说明通过共生质粒的转移可以提高根瘤菌的共生固氮能力。但共生基因的相互作 用是多方面的，对共生固氮能力的影响可以是正的效应，也可以是负的效应或无显著影响。ＤｅＪ ｏｎｇ等［１１］将ｐＲＬ３ＪＩ引入豌豆根瘤菌３００之后，对其共生固氮能力没有显著影响， 而将ｐＲＬ３ＪＩ及ＰＪＢ５ＪＩ引入菌株３００，转移接合子接种的植物的含氮量及结瘤数反而 降低，张学贤［１２］亦发现ｐＪＢ５ＪＩ导入Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ２２１０，２２ｌ０（ｐ ＪＢＪＩ）接种植株的地上部分干重显著低于出发菌株２２１０接种的植株。近年来有报道表明： ｎｉｆＡ基因不仅能控制固氮酶基因，而且能控制根瘤成熟和类菌体的存在时间［４］。本实验中 外源重组质粒ｐＣＫ３的ｎｉｆＡ基因能在慢生型花生根瘤菌１４７－３的遗传背景中通过与受体 菌基因的相互作用，使转移接合子ＨＮ１４的共生固氮能力提高。我们认为ＨＮ１４工程菌株可能 是由于导入的ｎｉｆＡ基因在共生固氮过程中加强了正调节因子ｎｉｆＡ的作用，从而提高了共生 固氮效率。实验表明，利用转移接合方法将含有与共生固氮有关基因的外源质粒导入花生根瘤菌进 行花生根瘤菌的遗传育种工作是可行的。外源共生基因能否在受体根瘤菌中稳定存在，不仅决定了 共生基因间的相互作用，还决定了外源共生基因的表达。由于目前根瘤菌遗传学研究中所使用的载 体质粒都存在一定程度的不稳定性，给育种研究工作带来一定的困难。本实验中，外源共生基因的 载体质粒ｐＲＫ２９０的不稳定性表现在载体质粒的丢失。转移接合子ＨＮ１４在实验应用中能否 表现出高竞争结瘤能力，发挥高效固Ｎ作用，有待进一步开展田间试验。参考文献｜｜１Ｐａｎｋ ｈｕｒｓｔＣＥ．Ｓｙｍｂｉｏｔｉｃｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒ ｅｓｉｓｔａｎｔｍｕｔａｎｔｓｏｆｆａｓｔ－ａｎｄｓｌｏｗ－ｇｒｏｗｉｎｇｓｔｒａｉｎ ｓｏｆＲｈｉｚｏｂｉｕｍｎｏｄｕｌａｔｉｎｇｌｏｔｕｓｓｐｅｃｉｅｓ．ＣａｎＪＭｉｃｒ ｏｂｉｏｌ，１９７７２３：１０２６～１０３３２ＴｒｉｎｉｃｋＭＪ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈ ｉｐａｍｏｎｇｓｔｔｈｅｆａｓｔ－ｇｒｏｗｉｎｇＲｈｉｚｏｂｉａｏｆＬａｂｌａｂｐｕｒ ｐｕｒｅｕｓ，ＬｅｕｃａｎｅｎａＬｅｕｅｏｃｅｐｈａｌａ，Ｍｉｍｏｓａｓｐｐ．，Ａｃａ ｃｉａｆａｒｎｅｓｉａｎａａｎｄＳｅｓｂａｎｉａｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａａｎｄｔｈｅｉｒ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓｗｉｔｈｏｔｈｅｒＲｈｉｚｏｂｉａｇｒｏｕｐｓ．ＪＡｐｐｌＢａｃｔ ｅｒｉｏｌ，１９８０，４９：３９～５３３ＫｏｎｄｏｒｏｓｉＡ．Ｍｏｂｉｏｌｏｚａｔｉｏ ｎｏｆａＲｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉｍｅｇａｐｌａｓｍｉｄｃａｒｒｙｉｎｇｎｏｄ ｕｌａｔｉｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｖｎｇｅｎｅｓｉｎｔｏｏｔｈｅｒＲｈｉ ｚｏｂｉａａｎｄＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ，ｌ９８２．８８：４ ３３～４３９４ＳａｎｊｕａｎＪ．Ｍｕｌｔｉｃｏｐｙｐｌａｓｍｉｄｓｃａｒｒｉｎｇｔｈｅ ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｎｉｆＡｇｅｎｅｅｎｈａｎｃｅＲｈｉｚｏｂｉｕ ｍｍｅｌｉｌｏｔｉｎｏｄｕｌａｔｉｏｎｃｏｍ－ｐｅｔｉｔｉｖｅｎｅｓｓｏｎＡｌｆａｌｆａ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ－ｍｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，ｌ９９１，４（４）：３６５～３６９５ＭａｎｉａｔｉｓＴ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＮｅｗＹｏｕｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８２６Ｄｉｔｔ
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