固氮酶的结构和功能研究进展（综述）尤崇杓（中国农业科学院原子能利用研究所，北京１０００９ ４）摘要：本文系统地介绍了近年来有关共生、自生和联合固氮菌固氮酶铁蛋白和钼铁蛋白两组分 的研究进展和发展趋势，并着重阐述了固氮酶组分、结构、活性调节和酶促反应机理关键词：固氮 酶；结构；功能各种固氮生物无论是共生的根瘤菌，弗兰克氏菌（放线菌）与满江红鱼腥藻，还是 自生、联合固氮细菌、蓝藻和光合固氮细菌，它们之所以能将空气中分子态氨素在常温常压下固定 下来，转化成可供有机体利用的化合态的氨，都是通过其体内的一种具有催化功能的蛋白质──固 氮酶来完成的［１］。这种生物固氮作用过程是地球上氮素循环的重要部分。它所固定的分子氮量 占全部自然界和工业合成的氮量的６０％左右［２］。因此，探索固氮酶的结构及其作用的机理， 就始终是生物固氮研究中的热点。它的阐明，不仅可以提高固氮生物的固氮能力，为农业生产开辟 肥源，而且也为人工模拟固氮酶的活动，在温和条件下还原分子氮，使工业合成氨的催化剂起一个 革命性变化［３］。１固氮酶的组分和结构１．１固氮酶的组成和命名１）组成一般的固氮酶都是 由铝铁蛋白和铁蛋白组成。这两种蛋白单独存在时都不呈现固氮酶活性，只有二者加合在一起，形 成复合体后，才具有催化氮还原成氨的能力。两者在生物体内的比例尚不清楚。但在体外，活性复 合体中二者的分子比例为１：１或１：２［４］。２）命名固氮酶的两种蛋白通常称为钼铁蛋白和 铁蛋白，或分别称为组分１和组分２。也有称之为固分子氮酶（Ｄｉｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ）和 固分子氮酶还原酶（Ｄｉｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ），而复合体则统称为固氮 酶（Ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ）。鉴于固氮酶有物种的特异性，所以还有以不同来源固氮酶组分命 名的。每种固氮酶组分用３个符号表示，第一个大写字母取自该固氮生物的属名，第二个小写字母 为种名，第三个数字“１”代表组分１，即铝铁蛋白，“２”代表组分２，即铁蛋白，例如：棕色 固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）的两种蛋白，分别称为Ａｖ１和Ａｖ２ ；褐球固氮菌（Ａ．ｃｈｒｏｏｃｏｏｃｕｍ）为Ａｃ１和Ａｃ２，而柱孢鱼腥藻（Ａｎａｂａｅ ｎａｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）则改称为Ａｃｙ１和Ａｃｙ２等。这种写法既简单又明了，是目前已 被广泛采用的命名法。还有其它命名法，由于现在已不通用，也就不一一列举了［４］。１．２固 氮酶的结构１）铁蛋白固氮酶铁蛋白是由两个相同亚基组成的二聚体，分子量约５９～７３ｋＤ， 因菌种不同而略有差异。每个亚基的分子量约３０ｋＤ。铁蛋白不含铝，每分子二聚体中含４ｇ原 子铁和４ｇ原子酸不稳定性硫，组成一个［４Ｆｅ－４Ｓ］的原子簇［５］。许多固氮生物如巴氏 芽孢梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐａｓｔｅｉｔｒｉａｎｕｍ），棕色固氮酶，肺炎克氏杆菌 （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ），鱼腥藻７１２０，大豆根瘤菌（Ｂｒａｄｙｒ ｈｉ≈ｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ），苜蓿根瘤菌（Ｒｈｉ≈ｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ） 等等代表不同属种的固氮酶铁蛋白的一级结构都已测定［６～２６］。其中都不含色氨酸，酸性氨 基酸均高于碱性氨基酸，各属种间的同源性为４５％～９０％．说明铁蛋白的基本结构是较为保守 的，特别是５个半胱氨酸残基都处于高度保守区内，其中２个对话性起主要作用的半胱氨酸残基与 ［４Ｆｅ－４Ｓ］簇配位［２］。同时，所有铁蛋白都在第１０１位（或１００位）处有一个精氨 酸残基。这些都决定了铁蛋白的功能。目前，棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的晶体结构已在２．９分辨 水平进行了测定。铁蛋白的每个亚基都折叠成一个单一的α和螺旋β折叠交替的结构域。在一个表 面由［４Ｆｅ－４Ｓ］连接在一起，形象犹如一个以铁硫簇为中心的肺或蝴蝶。在每个亚基的核心 是一个由８个β折叠肽片段形成的平面，侧面与９茶α－螺旋相接。［４Ｆｅ－４Ｓ］簇对称性地 与每个亚基上的两半胱氨酸残基（９７和１３２位）形成配位链，并暴露在分子表面［２７］。两 个亚基的第９８位的甘氨酸的侧链也与［４Ｆｅ－４Ｓ］簇相接触。在铁蛋白的Ｎ末端的９～１６ 位发现有一个甘氨酸－Ｘ－Ｘ－Ｘ－甘－赖－丝／苏氨酸的序列，称为ＷａｌｋｅｒＡ肽段，形成 一个β折叠－环－α螺旋结构，同时在末端的１２５～１２８位有一个ＷａｌｋｅｒＢ肽段。这是 单核苷酸结合蛋白所具有的特征。可能是ＭｇＡＴＰ与铁蛋白结合的位点［２８］，这将在下面进 一步讨论。２）钢铁蛋白固氮酶钼铁蛋白是由分子量分别为５１ｋＤ和６０ｋＤ的两α亚基和两β 亚基组成的四聚体（α２β２），分子量约为２２０～２４５ｋＤ。一些固氮生物的固氮酶铝铁蛋 白的一级结构也已测定［８，２９～４１］。其氨基酸序列有４７％～６６％相似，保守性都相当 高，尤其是半胱氨酸，其位置往往相同或相近，推测是与铁、铝形成配位键所必需。钼铁蛋白α亚 基的Ｎ末端区的长度与同种铁蛋白的Ｃ末端的长度具有对称关系，其长度依下列种属来源的蛋白递 减：柱孢鱼腥藻＞苜蓿根瘤菌＞肺炎克氏杆菌＞棕色固氮菌＞巴氏芽孢梭菌。这种对称关系可能会 决定活性固氮酶复合体的形成，并与不同种的两组分蛋白互补时，显示酶活性密切相关。每分子铝 铁蛋白含有２个原子钼，２４～３２个原子铁和相应数目的酸不稳定性硫。这些金属原子大致分别 为三种状态：Ｐ中心（或簇），约含１６个铁，与相应数目酸不稳定硫组成的４个［４Ｆｅ－４Ｓ ］簇；Ｍ中心（或簇），含２个铝，１４个铁和１６～１８个酸不稳定硫组成了两个铁钼辅因子和 一个尚有争议的Ｓ中心（或簇），约含１～２个铁原子［４］。３）铁钼辅因子（ＦｅＭｏｃｏ） 钼铁蛋白中金属组分Ｍ簇是铁钼辅因子（ＦｅＭｏｃｏ）的非共价结合的前体，ＦｅＭｏｃｏ被认 为是固氮酶的活性中心，１９７７年已用酸处理钼铁蛋白后，用有机溶剂将ＦｅＭｏｃｏ提出，在 有机溶剂中ＦｅＭｏｃｏ是稳定的。每分子钼铁蛋白含两个ＦｅＭｏｃｏ。它能活化铁失ＦｅＭｏ ｃｏ的钼铁蛋白变种。每个ＦｅＭｏｃｏ含１个Ｍｏ，７个Ｆｅ和８～９个酸不稳定硫和一个高柠 檬酸分子。不含其它可觉察的有机物如氨基酸、糖类、辅酶Ａ、硫辛酸等。分子量约８００Ｄ［５ ］。ＦｅＭｏｃｏ是钼铁蛋白中特征电子顺磁共振（ＥＰＲ）信号的来源。４）钼铁蛋白结构棕色 固氮菌和巴氏梭菌的钼铁蛋白的大结晶已于１９８０年获得，经过１０多年的努力，终于在１９９ ２年，两种蛋白晶体结构分别完成了２．９和３．０水平的Ｘ衍射分析测定，并对棕色固氮菌和巴 氏梭菌的ＦｅＭｏｃｏ和Ｐ簇进行了２．２分辨水平的分析［２９～３２］。钼铁蛋白的α和β亚 基呈现出相似的折叠，都出三个α／β型结构域和一些单独的α螺旋组成。每个亚基有三个结构域 。它们间有一个裂缝，ＦｅＭｏｃｏ位于α亚基上裂缝的底部。钼铁蛋白的α２β２四聚体实际上 是由两个一、聚体非时称地组成，Ｐ簇对位于αβ二聚体的界面。在二聚体中α和β亚基由通过Ｐ －簇对的双折叠轴相互交联。与αβ二聚体相关联的四聚体的双折叠轴为β亚基的α螺旋所包围， 并形成一个直径１０通道［２９～３０］。每个ＦｅＭｏｃｏ由（４Ｆｅ：３Ｓ）和（１ＭＯ：３ Ｆｅ：３Ｓ）簇对，通过三个非蛋白的配位体相桥联而构成（图３Ａ），桥联位置上的Ｆｅ－Ｆｅ 距离为２．５，而在两簇上非桥联的铁部位间的距离为３．８。根据电子密度值分析，两个桥联配 位体为硫，而第三个配位，电子密度较低，称为“Ｙ”，在巴氏梭菌中为可能是Ｓ，而在棕色固氮 菌中还可能是一个有序的Ｏ／Ｎ组，目前尚不清楚。高柠檬酸通过其－ＣＯ和－ＯＨ的两个氧原子 与铅配位，完整的簇只基在α亚基上通过２７５位半胱氨酸残基和４４２位的组氨酸残基与其配位 结合，还有一个１９１位的甘氨酸残基的氢键通过高柠檬酸与其非直接的配位，ＦｅＭｏｃｏ结构 的不寻常之处，是连接两个簇之间的６个Ｆｅ呈现出三角形几何学配位，在这些桥联的Ｆｅ配位距 离内，未发现Ｆｅ－Ｆｅ键的相互作用，和可能形成第４个配位的蛋白质基团或溶剂分子［３１， ３２］。Ｐ－簇对是由两个［４Ｆｅ，４Ｓ］簇通过两个半胱氨酸残基（α８８和β９５）的Ｓ邻 近的Ｆｅ相配位桥联而成的，在棕色固氮菌中，其键长为２．１．而巴氏梭菌中则更短些，其余４ 个Ｆｅ各自与半胱氨酸残基（α６２，α１５４，β７０和β１５３）单独配位。Ｐ－簇上的Ｆｅ ６和Ｆｅ２又分别与丝氨酸（β１８８）和甘氨酸（α１８５）残基相互作用。从而破坏了典型的 四面体环境。Ｆｅ６和Ｆｅ２间为二硫键所连接［３１，３２］。１．３固氮酶的多态性随着固氮 研究的广泛和深入开展，在不同原核生物属中又发现了许多新的固氮生物。它们在自然界的进化过 程中，所处的环境有很大的差异，呈现出生物体的多样性。因此，尽管含钼的固氮酶在固氮生物中 普遍存在，而且其结构还相当保守。但是，毫不例外地显示出其多态性。这首先可以从固氮（ｎｉ ｆ）基因的差异中看到。就以编码固氮酶的结构基因（ｎｉｆＨＤＫ）而言，田箐根瘤菌（Ａｚｏ ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）编码铁蛋白的ｎｉｆＨ基因有两个拷贝，大豆根瘤 菌的ｎｉｆＨＤＫ之间不连锁等，这些都与肺炎克氏杆菌的不同。至于全部的ｎｉｆ基因，则不同 属种间的差别更大［１，４］１）固氮酶铁蛋白的活化酶１９７６年Ｌｕｄｄｅｎ等发现在深红红 螺菌（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ）一种光合固氮菌的固氮酶需要一种活化组分 才有催化活性。这种活化因子是一种酶，称为活化酶。它对目前已知的光合固氮细菌和一些固氮螺 菌的固氮酶铁蛋白活化是必需的。在上述的固氮生物的固氮酶中，铁蛋白的两个亚基有两种形态：一个是活性态（或称非修饰态）分子量３３．５ｋＤ，另一个是无活性态（或称修饰态），分子量为３８ｋＤ，修饰态铁蛋白是在其一亚基的１００位（或１０１）精氨酸上为磷酸盐，五碳糖和腺嘌呤（１：１：１）组成的基团所修饰。现已证明，在有结合态氮时，铁蛋白ＡＤＰ－核糖基转移
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