水稻根际固氮粪产碱菌的研究（综述）尤崇杓，方宣钧（中国农业科学院原子能利用研究所，北京１ ０００９４）摘要：粪产碱菌分离自我国南方水稻田中，根据系统发育分类法属变形细菌中β亚类 。粪产碱菌不仅能附着于水稻根表，部分细菌还能进入稻根细胞内，有较高的固氮能力，在高铵下 它们能合成固氮酶，并具有明巳的ＰＧＰＲ作用。本文系统地论述了粪产碱菌的生物学特性及其联 合固氮研究的进展。关键词：粪产碱菌；
水稻根际：联合固氮水稻是重要的粮食作物，大约占世界 一半以上的人口以食用稻米为主。在我国水稻播种面积占整个粮食作物播种面积的２５％～３０％ ，总产量则占全国粮食总产量的４０％～４５％。在我国有２／３的人口以稻米作为主食，随着人 口的不断增长，耕地面积的日益减少，提高单位面积产量，是当今水稻生产的重要课题，除了品种 改良以外，以化肥运筹为中心的各种栽培技术，是提高单产的有效途径：然而大量地使用化学肥料 ，不仅消耗了大量的能源，还引起了严重的环境污染，使生态平衡遭到严重的破坏。如何解决这些 问题是全世界所关切的。生物固氮是解决这些问题的有效办法之一。迄今为止，水稻等禾本科作物 尚不能象豆科植物那样进行自主固氮，即使是能象豆科植物那样自主固氮，如果以降低产量为代价 也是不足取的。联合共生固氮作用是当前解决禾谷类作物部分氮素来源的途径之一。浸水稻田具有 微生物生长的优越条件，有丰富的微生物区系，各种固氮微生物活动极为活跃，联合固氮菌不仅能 固氮，而且还起着ＰＧＰＲ的作用。据统计，全世界水稻田固氮量每年可达４００×１０６ｔ．这 一数字超过当今世界农作物氮化肥全年使用量的１１％［１］。联合固氮的研究，自１９７４年以 来，得到了迅速的发展。从１９７４年的第一届到１９９２年的第九届国际固氮会议都设有联合固 氮专题；而以“联合固氮”为主的每三年一次的国际非豆科固氮会议也已召开了６次。至于联合固 氮菌，也从开始时两种菌株，即含脂固氮螺菌（Ａ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）和巴西固氮螺菌（Ａ． ｂｒａｓｉｌｅｎｅｓ）．发展到许多属、种。它们大多是从不同地区，不同作物根际中分离出来 的，例如日本的催娩克氏杆菌（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）、国际水稻所和加拿大的假单胞菌（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）、德国的产气肠杆菌（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等，我国也分离出粪 产碱菌（Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、稻黄杆菌（Ｆ．ｏｒｙｚａｅ）等。这些新固氮细菌的发现不 仅丰富了固氮资源，也为联合固氮的开发利用带来了光辉的前景。自１９７８年以来，我们实验室 对粪产碱菌进行了较为系统的研究［２］。作者通过对本实验室十多年的研究工作的总结，系统地 论述了固氮粪产碱菌的生物学特性，以及在水稻联合共生体系中的作用。１粪产碱菌（Ａ．ｆａｅ ｃａｌｉｓ）在系统发育分类中的位置系统发育分类法是依据进化关系进行分类的，是当前被认为 较好的一种分类方法。这种分类是根据细菌中ｒＲＮＡ（主要是１６ＳＲＮＡ）的相似性研究细菌 的相互关系。ｒＲＮＡ的相似性是通过ｒＲＮＡ与总ＤＮＡ杂交，编排和序列分析等三个步骤来完 成的。杂交的数据对许多属、种，特别是对变形细菌（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）能提供更 为详细的结果。在这种分类法中ｎｉｆＨ基因序列具有重要的参考价值。变形细菌（ｐｒｏｔｅｏ ｂａｃｔｅｒｉａ）根据杂交结果编排，可分为４个ｒＲＮＡ“超科”（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ）：一为α亚类（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）；二为β亚类；三为γ亚类；四为δ亚类［３］。粪 产碱菌作为一种固氮菌根据这一分类法是属变形细菌中亚类，在这一亚类中固氮细菌极少，研究得 也不多，大多数固氮菌属或亚类。关于亚类中的固氮螺菌（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｐ．）与 植物间相互作用，已有许多报道和综述［４，５］。而对遗传背景差别较大的亚类中的粪产碱菌的 研究却几乎是空白。粪产碱菌是我国第一次发现的产碱菌属中的一个固氮菌［６］。其后又发现了 巨大产碱菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ．ｌａｔｕｓ）［７］。粪产碱菌的发现，为变形细菌亚类 增添了一个新的固氮菌种，它也逐渐为世界上所确认［５．８．９］，其后我们又发现了争论产碱 菌（Ａ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、反硝化产碱菌（Ａ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）的木糖亚种 （ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｏｓｏｘｙｄｏｎｓ）和反硝化亚种（ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃ ａｎｓ）［１０］。２粪产碱菌（Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ）的理化特性粪产碱菌（Ａｌｃａｌｉｇ ｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）Ａ１５菌株是革兰氏阴性杆菌，直径约为０．７～１．０ｍ，周生鞭 毛运动。在以苯甲酸盐为碳源的无氮平板培养基上，３０℃培养５天，菌落园形，表面光滑、突起 、边缘整齐，直径１～１．５ｍｍ，并产生黑色素。呼吸代谢，氧化酶阳性，不利用糖类生长，石 蕊牛奶产碱［１１］。粪产碱菌是微好氧固氮菌，在无氮的半固体培养基上生长和固氮良好，乙炔 还原活性可达５００～７００ｎｍｏｌ·ｍＬ（－１）·ｈ（－１）［１２］。每消耗１ｇ碳源可 固定４０ｍｇ氮［１３］。粪产碱菌（Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ）Ａ１５０１菌株为本研究室对原有 Ａ１５菌株进行了提纯、复壮。其性状略有变异［１０］。粪产碱菌是一种含有吸氢酶的兼性化能 自养细菌，具有较强的吸氢能力，同时，可以利用氢为能源同化ＣＯ２营化能自养生活［１４］， 这与固氮巴西螺菌（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｃｅ）相似［１５］。在固氮过 程中，放氢及氢引起能量损耗，抑制固氮酶，但从氢到氧的电子传递过程中，也能增加氧的消耗， 防止氧对固氮酶活性的抑制作用［１６，１７］。在同化ＣＯ２时，由ＲｕＢＰＣ（Ｒｉｂｕ－ｌ ｏｓｅ１，５－ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅＣａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）起固定ＣＯ２作用［１８］。 在呼吸电子受体（Ｏ２，和Ｎ２Ｏ）有限的情况下，能形成多聚－羟基丁酸（Ｐｏｌｙ－β－ｈｙ ｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ，ＰＨＢ），ＰＨＢ在微氧条件或逆境条件下（如渗透冲击，紫外辐 射）为固氮作用贮存碳源和能源［１９］。粪产碱菌在Ｎ２生长中，比在ＮＨ４生长中积累更多的 ＰＨＢ［１４］，与固氮螺菌［２０］和Ａ．ｌａｔｕｓ［７］中所得结果相似。粪产碱菌在氮素 培养条件下，氮素同化途径为谷酰胺合成酶（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＧＳ） 与谷氨酸合成酶（ＧｌｕｔａｍａｔｅＳｙｓｔｈａｓｅ，ＧＯＧＡＴ）途径［２１］，即ＧＳ－ ＧＯＧＡＴ途径。在ＧＳ－ＧＯＧＡＴ途径中，谷氨酸与ＮＨ３在谷酰胺合成酶的作用下，合成为 谷氨酰胺，这个反应消耗１个ＡＴＰ并需要Ｍｇ（２＋）参予。第二步，在谷氨酸合酶催化下，谷 氨酰胺把酰胺基转移给α－酮戊二酸，生成二分子谷氨酸。二个步骤的反应如下：二分子谷氨酸， 一个返回ＧＳ－ＧＯＧＡＴ途径，另一个经过转氨基作用合成其它氨基酸。目前，粪产碱菌的ＧＳ 已经分离、提纯，其特性与其它固氮菌相似［２２］。粪产碱菌在铵培养下，氮素同化是通过谷氨 酸脱氢酶途径（ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｔｈａｓｅ，ＧＤＨ），即ＧＤＨ途径。在 ＧＤＨ的作用下，α－酮戊二酸铵化为谷氨酸，然后再由转氨酶将谷氨酸和氨基转移合成其它氨基 酸，其反应式如下：在和二种氮源同时存在时，粪产碱菌优先利用作为氮源，菌体不能合成硝酸还 原酶［２３］。但在好气条件下，无论哪一种状态氮都抑制固氮活性。在厌氧条件下，的存在并不 能抑制硝酸盐的利用。不是作为氮源而是作为末端电子受体接受无氧呼吸传递电子，还原成，同时 发生磷酸化作用，产生ＡＴＰ供生长所需。应用￣１５进行反硝化试验进一步证实，在厌氧条件下 粪产碱菌能利用硝酸盐进行反硝化作用，经等中间氮氧化物，最后生成Ｎ２［２３］。亚硝酸盐即 使在低浓度下也对菌体的生长有一定抑制作用，浓度愈高，菌体生长的延迟期愈长。好气条件下的 存在并不抑制的代谢。粪产碱菌能在氧和存在下利用，表明该菌中除硝态氮同化途径外．还有一条 能将ＮＯ２转化为对生长无毒害物质的代谢途径［２３］。各种固氮微生物都存在其固氮酶活性受 环境中铵盐抑制问题，而Ｍａｒｉｓ等认为，并不抑制棕色固氮菌的固氮酶合成［２４］。Ｅｌｍ ｅｒｉｃｈ等（１９８６）在研究固氮螺菌时发现，环境中铵浓度超过３０ｍｍｏｌ·ｈ（－１） 、发生酶的异化作用，抑制了固氮活性［２５］，然而粪产碱菌在高达３０ｍｍｏｌ·Ｌ（－１） 的培养条件下，仍有固氮酶的合成，但可能由于固氮产物铵盐积聚的反馈抑制阻遏了某些调节因素 ，例如在ＳＤＳ－ＰＡＤＥ中出现的分子量５０ｋＤ左右的蛋白，以致阻遏固氮酶活性。解阻遏后 ，在有条件下合成的固氮酶仍可表现固氮活性［２１．２６．２７］。在好气条件下，与相似，抑 制固氮酶活性，随着硝酸盐浓度提高，固氮活性显著降低。在厌氧条件下，粪产碱菌具有需硝酸盐 的固氮酶活性，硝酸盐浓度１ｍｍｏｌ／Ｌ左右，培养９ｈ，固氮酶活性达最高峰。用亚硝酸盐， 则固氮活性受到抑制［２３．２８］，硝酸盐的呼吸作用受分子氧竞争抑制，它只发生在厌氧条件 下。在氧存在时，硝酸盐只能作为外源氮供菌利用，并抑制固氮活性。在厌氧条件下，末端电子则 传递给。电子传递过程中产生的能量能支持固氮作用［２９］，从而大大提高了固氮效率，已有报 道，在一些反硝化细菌中，未观察到以亚硝酸盐作为最终电子受体的磷酸化作用［３０］：３粪产 碱茵对水稻生长发育的促进作用联合固氮作用的研究多集中于接种固氮菌对田间作物的效应和植物 与微生物相互作用机理两个领域内［３１］。大量的田间接种实验表明，不同禾谷类作物接种联合 固氮菌后，对植物都产生了不同程度的有益效果，但并不总是能增加植物的产量［３２，３３］，接种联合固氮菌所产生的增产效果，则被普遍认为是促进植物生长或抑制植物病原菌所致［３４．３５］。也有报道认为，联合固氮菌所固定的氮，至少有５％进入植物［３６］。接种后，增加了根系质子流，从而提高了吸收矿质养分的能力等［３７］。毫无疑问，接种联合固氮菌对植物能产
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