固氮粪产碱菌ｎｉｆＨ基因的亚克隆及其启动子的核苷酸序列分析张海予，林敏，方宣钧，尤崇杓（ 中国农业科学院原子能利用研究所．北京１０００９４）朱玉贤（北京大学蛋白质工程及植物基因 工程国家重点实验室，北京１００８７１）摘要：采用￣３２Ｐ标记的巴西固氮螺菌Ａｚｏｓｐｉ ｒｌｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＳｐ７ｎｉｆＨＤＮＡ探针，对不同限制性内切酶完全酶解的粪 产碱菌ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓＡ１５０１总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交 分析，证明在粪产碱菌中存在与ｎｉｆＨ同源的ＤＮＡ序列。在不同浓度下测定ｎｉｆＨ－ｌａｃ Ｚ融合基因在粪产碱菌结合子中的β—半乳糖苷酶活性，结果证明该融令基因的表达受粪产碱菌基 因调节系统的控制。构建了粪产碱菌总ＤＮＡＥｃｏＲＩ酶解的质粒文库。经两轮菌落筛选获得含 ｎｉｆＨ同源序列的４．７ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段的阳性克隆ｐＢＺ１。ｎｉｆＨ启动子区的 核苷酸序列分析结果表明，该启动子具有ｎｉｆ基因的保守结构关键词：粪产碱菌；ｎｉｆＨ；启 动子；序列分析按系统发育分类法，大多数固氮微生物如肺炎克氏杆菌Ｋｌｅｂｉｅｌｌａｐｎｕ ｍｏｎｉａｅ和巴西固氮螺菌等均属变形细菌中的α和γ亚类。在进化过程中，编码固氮酶铁蛋白 组分的结构基因ｎｉｆＨ核苷酸序列具有高度的保守性，因而，ｎｉｆＨ基因核苷酸序列在分类学 上具有重要的参考价值［１］。在目前已知的固氮菌中，ｎｉｆＨＤｋ基因簇组成一个操纵子，启 动子位于ｎｉｆＨ基因上游。该启动子结构也有一定的保守性，一般具有ＡＴ富集区、核糖体结合 （ＳＤ）位点、上游活化序列（ＵＡＳ）、转录启始点、ＶｔｒＡ结合位点和反向重复序列等［２ ］。这种结构上的保守性使得大多数属α或γ亚类的固氮菌在ｎｉｆ基因的表达调控上，尤其是在 受和氧的阻遏上十分相似［３］。固氮粪产碱菌首次分离自我国南方水稻根际，属变形细菌中的β 亚类［１］。本试验室曾在高铵和好氧条件下分离纯化了ｎｉｆＨＤＫ的产物铁蛋白和钼铁蛋白， 但无固氮活性［４，５］。这表明粪产碱菌ｎｉｆ基因的表达调节不同于另两类已进行了大量研究 和报导的固氮菌。本工作克隆了粪产碱菌ｎｉｆＨ基因，并对其上游的启动子区域进行了核苷酸序 列分析。１材料与方法１）菌株与质粒粪产碱菌Ａ１５０１培养条件及培养基配方按林敏和尤崇杓 （１９８７）方法［６］。大肠杆菌在ＬＢ培养基上生。抗生素在培养基中的最终浓度：四环素（ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）为１０μｇ·ｍｌ（－１），卡那霉素（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）为５ ０μｇ·ｍＬ（－１），氨节青霉素（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）为５０μｇ·ｍＬ（－１）。ｎｉ ｆＨ探针和ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ融合基因由Ｅｌｍｅｒｉｃｈ博士赠送［３］。国家８６３项目资 助课题２）质粒文库的构建、菌落杂交、细菌转化试验和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法参见Ｍａｎｉ ａｔｉｓ（１９８２）方法［７］，试验所用的限制性内切酶，Ｔ４－ＤＮＡ连接酶及有关的试剂 均购自Ｐｒｏｍｍｇａ公司。３）β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性测定按Ｍｉｌｌｅｒ（１ ９７２）方法［８］。４）核苷酸序列测定Ｔ７ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ购自Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ公司，按其说明书进行。２结果与讨论２．１粪产碱菌ｎｉｆＨ同源序列的鉴定及异源ｎｉｆ ＨｌａｃＺ的表达粪产碱菌Ａ１５０１总ＤＮＡ经ＢｇｌⅡ，ＰｓｔＩ，ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ四 种限制性内切酶完全酶解，采用巴西固氮螺菌ｎｉｆＨＤＮＡ为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分 析证明，在粪产碱菌中存在ｎｉｆＨ的同源序列，其中ＥｃｏＲＩ完全酶解产物仅显示出一条４． ７ｋｂ左右的杂交带（图１）。通过两亲转移试验获得含ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ的粪产碱菌结合子（ 待发表材料）。结合子在不同浓度下３０℃培养１２ｈ，测定β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活 性。结果表明：当浓度高达６０ｍｍｏｌ·Ｌ（－１）时，外源ｎｉｆＨ在粪产碱菌仍有低水平表 达（表１）。但比在巴西固氮螺菌中要高２０倍［９］。异源ｎｉｆＨ在粪产碱菌中的表达表明在 粪产碱菌中存在ｎｉｆＨ－ｌｉｋｅ基因以及调控系统。固氮酶钼铁蛋白和铁蛋白两组分由ｎｉｆ ＨＤＫ三个基因编码，由于固氮酶的正调节基因产物ＮｉｆＡ首先激活ｎｉｆＨ上游的启动区，为 此有必要克隆粪产碱菌的ｎｉｆＨ基因以及５’端的启动区，以便探讨在高铵下组遏固氮酶合成的 机理。２．２质粒文库的构建及ｎｉｆＨ的亚克隆粪产碱菌总ＤＮＡ的ＥｃｏＲＩ完全酶解产物与 Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＳｐ７ｎｉｆＨ探针杂交后只有一条４．７ｋｂ的杂交带。为克隆该Ｅ ｃｏＲＩ片段，首先将ＥｃｏＲＩ完全酶解的细菌总ＤＮＡ与ＥｃｏＲＩ酶解的载体ｐＢＳＤＮＡ 连接，连接产物转化大肠杆菌，在含Ａｍｐ和ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ板上挑取白色重组菌落，构建质粒 文库。以Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＳｐ７ｎｉｆＨＤＮＡ为探针进行两轮菌落杂交，结果获得含 ｎｉｆＨＤＫ同源序列的４．７ｋｂＥｃｏＲＩ片段的阳性克隆（待发表材料），定名为ｐＢＺ１ （图２）。采用限制性内切酶ＢｇｌⅡ，ＰｓｔＩ．ＫｐｎＩ单切酶或双酶切处理ｐＢＺＩ质粒， 根据酶切结果建立４．７ｋｂＥｃｏＲＩ片段的限制性内切酶图谱，采用肺炎克氏杆菌ｎｉｆＨ头 尾两部分ＤＮＡ片段作探针分别进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，根据杂交结果定位粪产碱菌ｎｉ ｆＨ基因（图３），确定完整的ｎｉｆＨ及其启动区位于ＥｃｏＲＩ－ＰｓｔＩ双酶切的３．０ｋ ｂ的片段上，将此片段亚克隆，然后进行核苷酸序列分析。２．３ｎｉｆＨ启动子核苷酸序列和结 构分析粪产碱菌ｎｉｆＨ启动子核苷酸序列分析结果表明：在启动子上游－１２到－８处有ＳＤ序 列ＡＧＧＡＡ，－９０到－７５处有ｎｉｆ基因启动子所特有的同感序列ＣＴＧＧＣＡ－Ｎ６－Ｃ ＴＧＣＴ，－２０７到－１９２处有ＵＡＳ序列ＴＧＴ－Ｎ１０－ＡＣＡ，在同感和ＵＡＳ序列之 间有一段Ａ－Ｔ含量为８３％、碱基数为５２的Ａ－Ｔ富集区域（图４）。这与已报导的巴西固氮 螺菌ｎｉｆＨ启动子结构十分类似，说明ｎｉｆＨ启动子结构具有保守性［２］。目前，粪产碱菌 ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ融合基因的构建工作正在进行之中。从现有的试验证据来看，属β亚类的粪产 碱菌ｎｉｆ基因的表达调节可能与已作大量报道的基因调节系统有所差异。对此作深入研究既是对 联合固氮理论的丰富和扩展，同时对耐铵工程菌株的构建也有一定的指导意义。参考文献｜｜１Ｙ ｏｕｎｇＪＰＷ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｏｇｅ ｎ－ｆｉｘｉｎｇｏｒｇａｎｉｓｍｓ．ＩｎＳｔａｃｅｙＧ（ｅｄ．）：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｉ－ｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ＆ＨａｌｌＬｏｎｄｏｎ．１９９２，４ ３～１６５２ＢｅｙｎｏｎＪ，ＣａｎｎｏｎＭ，Ｂｕｃｈａｎａｎ－ＷａｌｌａｓｔｏｎＶ．Ｃ ａｎｎｏｎＦ．ＴｈｅｎｉｆｐｒｏｍｏｔｅｒｓｏｆＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｅｈａｖｅａｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｐｒｉｍａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｃｅｌｌ，１ ９８３．３１：６６４～６７１３ＺａｍａｒｏｃｚｙＭ，ＤｅｌｏｒｍｅＦ，Ｅｌｍｅｒｉｃｈ Ｃ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｒｒｎａｐｐ ｉｎｇｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃ－ｔｕｒａｌｇｅｎｅｓｆｏｒｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ（ＨＤＫ） ｏｆＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＳｐ７．ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｌ，１９８ ９．２２０：８８～９４４宋未，张凤瑞，尤崇杓．Ｎ＿２和培养下粪产碱菌固氮酶钼铁蛋白的合 成特性．植物生理学报，１９８９，１５：１６７～１７２５海伟力，宋未，尤崇杓．Ｎ＿２和培 养下粪产碱菌固氮酶铁蛋肉的生物合成及特性比较，植物生理学报，１９９２，１８：３５９～３ ６５６林敏，尤崇杓．粪产碱菌的反硝化与固氮作用．核农学报，１９８７，１：１～６７Ｍａｎ ｉａｔｉｓＴ，ＦｒｉｔｓｃｈＥ，ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ． ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ ｙＰｒｅｓｓ８ＭｉｌｌｅｒＪＨ．Ａｓｓａｙｏｆβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．Ｉｎｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ｏｒＬａｂｏｒａ－ｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９７２．３２５～３５５９ＬｉａｎｇＹＹ，Ｋａｍ ｉｎｓｋｉＰＡ，ＥｌｍｅｒｉｃｈＣ．ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｉｆＡ－ｌｉｋ ｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅｏｆＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＳｐ７ｅ ｘｐｒｅｓｓｅｄｕｎｄｅｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎａｎ ｄｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆａｉｒａｎｄａｍｍｏｎｉａ．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９１，５：２７３５～２７４４ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＧｅｎｅｎｉｆＨ ｏｆＡ．ｆａｅｃａｌｉｓａｎｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆ ｎｉｆＨＰｒｏｍｏｔｅｒ￥ＺｈａｎｇＨａｉｙｕ；ＬｉｎＭｉｎ；ＦａｎｇＸｕｎｊｕｎ；Ｙ ｏｕＣｈｏｎｇｂｉａｏ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４）ＺｈｕＹｕｘｉａｎ（ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙｏｆＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＥｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８７１）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｏｎｉｆＨｉｎＡ．ｆａｅｃａｌｉｓｈａｄｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｓｏｕｔｈｅｒｎｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈａｐｒｏｂｅｃａｒｒｙｉｎｇｔｈｅｎｉｆＨｇｅｎｅｆｒｏｍＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ
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