1风险评估的重要性早就有人提出或采用将有益的微生物应用到陆地环境中来防治农作物病原物或害 虫,甚至经基因改造的微生物(GEMs/GMMs)也被提出用于生物防治。从生态角度看,将 某种微生物释放到环境中产生了潜在的生态影响问题<1,2>。被释放到陆地环境中的微生物可 能会在植物残体上聚积。如果降解植物残体的有机体被破坏,可能会对生态环境造成不利影响。因 为在农业生态系统中植物残体的降解能对作物产量和农事操作产生重要的直接影响,以及对土壤的 各种进程(如硝化作用)和特性(如阳离子交换和持水能力)产生间接的影响。在自然生态系统中 ,植物残体的降解对维持初级生产必需元素的生物地理化学极为重要。由此可见,降解植物残体的 微生物群体组成和功能的长期变化能够打乱碳的积累和矿物质循环,以及维持植物生产所需的土壤 性质。如果生防菌有很强的腐生适应能力,那它对原有群体的取代作用和由此带来的影响就应当受 到正视。如果被取代的微生物在地理化学营养循环有重要作用,可能会对生态系统造成有害的效果 <3>。因此,不论是经过基因修饰或自然的微生物在商业化应用之前,一定要对其在农业环境中 的行为及对土壤生态系统的潜在影响进行风险评估。2微生物在土壤中的存在状态粘土-有机质复 合体是土壤微生物重要的结合体,其表面充满负电荷且营养供应能力强。土壤中绝大多数细菌包括 引入的生防菌通常通过不同的机制黏附在复合体的表面和内部。通常植物根围是活跃微生物聚集的 地方,这些位置的群体密度要比其他位置土壤中群体密度高几个数量级,这主要是由于植物根的分 泌物是许多微生物的营养来源,这被称为根围效应<4,5>。也许是由于这一原因,植物的种类 对土壤微生物的组成、存在状态都有很大影响,如Maria等人的研究发现,寄主植物的种类极 大地影响假单胞菌在根围的动态、组成和活力。生防菌从刚进入土壤中所在的位置向根围和根移动 ,并且定殖的能力是许多生防产品不能商业化应用的主要原因<6>。3生防细菌对土壤微生物群 落组成和功能的影响被释放到土壤环境中的不同细菌所产生的影响是不同的。对目标或非目标生物 的毒害作用可以依据被释放微生物的特性来预测,其他比较难预测的效应也可能随之发生。也许最 大的潜在影响是引入微生物对土壤小生境中原有微生物的取代作用。这能导致土壤生态系统的多样 性和/或机能降低。最重要的影响是对土壤隐身物(很难观察到的土壤有机体)的平衡和机能的冲 击。微生物的稳定性意味着使微生物多样性最大化,以确保在植物根部的微生物群落中的每个组成 部分都能各尽其职,发挥功效来提高植物的生长和健康,但是有些学者认为,尽管维持原始微生物 群落结构的平衡对促进植物生长很重要,但这并不是惟一能发挥有益效果的条件。就根部病害而言 ,这意味着拮抗潜能必须大到能抑制或杀灭病原物,或者能诱导植物产生抗病性。向土壤中引入生 防细菌可能会对群落中原有的非病原真菌产生非目标效应,尤其是引入经过基因改良的生防菌,因 为它们的某些能力通常被特别加强了。如Glandorf等(2001)将基因修饰的假单胞菌 GMM和未经修饰的野生型菌株WCS358r的引入均会对根围原有真菌微生物系统的组成产生 短暂的影响。WCS358r诱导产生的真菌微生物系统的变化很有可能是由其产生的假单胞菌素 和荧光嗜铁素造成的。其中嗜铁素是假单胞菌抑制康乃馨和萝卜上的镰刀菌引起的萎蔫病的前提条 件。GMM的引入对土壤真菌微生物系统组成的影响要比WCS358r更持久,并且两者引起的 变化在质量上不同,这种差异很可能是GMM产生的PCR(一种抑制真菌物质)所造成的。这表 明应用基因改良菌株能够对土壤中原有的真菌微生物系统产生非目标效应。对用这两种菌处理的小 麦根围PCR检测发现,GMM处理的小麦根围有PCR,而WCS358r处理的根围则没有。 但是所有引入的菌株,不论有没有经过基因修饰,都没有影响土壤微生物种群的代谢能力、土壤硝 化潜能、纤维素分解能力、植株的高度和产量。这些结果表明引入生防菌对土壤微生物群落可能没 有大的影响。Lin和Lottmann等(2000)人的实验结果似乎也验证了这一观点<6 ,7>。这也表明和野生型菌株相比,基因改良菌株对土壤微生态的影响并没有显著的差异。事实 上,通常菌株在基因改良设计的时候就被设计得尽可能与野生型菌株差异小,并且没有机能上的变 化,所以它们对土壤微生态系统几乎没有预想中的干扰<1>。4生防真菌对土壤微生物群落和功 能的影响在过去的一些研究中,向土壤中引入真菌作为生防因子对土壤原有的微生物群落组成和功能几乎没有影响。例如Mezzalama等人(1997)将基因修饰和未修饰的有拮抗作用的生防菌株Fusariumoxysporum接种到4块不同土壤中,通过最大或然数评估发现2个菌株对在土壤中执行重要 功能的氨化细菌、亚硝酸细菌、硝酸细菌、非共生的厌氧和好氧固氮菌、脱氮细菌都没有可以检测 到的影响。通过平板记数法亦未发现对土壤原细菌群体淀粉、蛋白、纤维素、果胶等物质降解以及 群体总数有影响。Trichodermaspp.能够抑制根部内生真菌的生长。菌根真菌(A M)或灌木菌根真菌(AMF)是一类比较特殊的真菌,它们生活在植物根表,与植物形成一种共 生系统,能够有效抵抗或延缓病原菌的侵入,因而关于其单独接种或与其他生防菌株协同接种所产 生的影响等研究较多,但它们的协同效应则尚不确定。例如,Vázquez等(2000)研究 发现,灌木菌根真菌在玉米根部的定殖会使根围细菌群落的质量发生变化,并且这种变化随着接种 种类的变化而表现出差异。随着接种菌种类的不同,反映根围微生物群落结构和生态功能的各种酶 活性也发生了变化<8>。在使用如Pseu-domonas和Trichoderma等生防 制剂时一定要特别注意,因为它们可能不仅与植物病原菌发生作用,而且可能与菌根真菌互作。被 释放的活体接种菌也能刺激菌根的定殖。反过来,菌根的形成能够直接或间接通过改变根的分泌或 真菌的分泌来影响根围微生物群落,这被称作是“菌根周围效应”。灌木菌根真菌(AM)的定殖 能增加根围好氧细菌的总数,而不是影响或减少。除此之外,AM的定殖可能会通过增加某些种群 和减少其他种群的数目来影响根围微生物群体中种的构成<9>。García等(2004)将一种外生菌根真菌(Pisolithustinctorius)和两种植物根围促生细菌PGPR(Bacillus licheniformisCECT 5106和Bacillus pumilusCECT 5105)分别或协同接种到一种当地橡树苗(Quercus ilexssp.ballota)的根部。结果发现,单独接种真菌的根上活的总体菌丝量比对照 的含量要高,但是当与细菌同时接种时,活菌丝含量显著降低。单独接种地衣芽孢杆菌促进了橡树 的生长,但是对根围总的微生物群落几乎没有影响,而当其与真菌协同接种后,则强烈抑制外生菌 根真菌的生长<10>。产生这种结果的原因可能是:细菌在根表小生境的排外作用;在根围微生 境内的水和营养竞争和/或细菌产生了抗真菌代谢物。5评估方法任何被释放的接种菌对土壤生态 系统影响的分析应该集中在对土壤系统或生态区系的有害影响方面<11>。以前人们常用某些特 定微生物群体来定义接种菌对土壤生态的影响。但是这种方法不能全面评价接种菌对土壤生态系统 机能的影响。酶活力被提出用来作为监测由接种菌和原有菌互作造成的土壤生态系统变化的工具< 12>。土壤酶活力经常被用作某一土壤微生物总体活力和土壤生产力的指标,并且可能更好地理 解外来因子对土壤生态系统功能干扰的本质有所帮助。常用的指标酶有:反映土壤分解代谢活力, 直接与微生物活力相关的酯酶(E.C.3.1.1.1);调节有机磷变为单质磷向土壤中的释 放的磷酸酶(E.C.3.1.3.1);降解作为大多数真菌细胞壁主要成分的几丁质并且可能 与植物对入侵病原物的防卫机制相关的几丁质酶(E.C.3.2.1.14);催化植物共生体 中非常普遍存在的海藻糖的水解的海藻糖酶(E.C.3.2.1.28)。土壤酶已经被成功地 用来评估接种菌Flavobacteriuspp.和Pseudomonasfluores cens对土壤生态系统的干扰。虽然研究中用的酶可能不一样,而且事实上不断有新的酶被应用 ,但是这些酶基本上都与微生物群落的某方面能力或化学组成相关。其他潜在反应外来微生物扰乱 的指标与微生物的生物量相关。如胞壁酸作为原核生物细胞壁的组分常被用作细菌生物群体总量的 指标,而麦角固醇被用来指示真菌的总量<11>。除了上述酶法,其他多种分子生物学方法被用 来研究引入生防菌后土壤微生物多样性和生态机能的变化,基本都是基于DNA的分析。从土壤中提出DNA后,通过PCR扩增,然后直接电泳分析,包括:变性梯度凝胶电泳(denaturinggradi-ent gel electrophoresis,DGGE)、温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)、核糖体DNA扩增片段限制性分析(am-plified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)、末端限制性片段长度多态性(Terminalrestriction fragment length polymorphism,T-RFLP)、核糖体基因间隔区分析(ribosomal in-tergenic spacer analysis,RISA)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)。用于引入研究生防菌后土壤微生物多样性和生态机能变化的分子生物学方法还包括:克隆建库后再电泳来对部分群落进行群落基因结构分析,也可以通过建库后测序然后与
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