近些年来,随着细胞生物学和分子生物学的不断发展、融合,植物分子育种技术加速了作物的优良性 状选择和育种进程。植物基因工程技术研究目前已取得了重大进展,在基因导入技术中,花粉管通 道法(pollen-tubepathway)已成功的运用于小麦、玉米、大豆、棉花等许多 农作物中,培育了许多抗病、抗虫及其它优良性状的农作物新品种。花粉管通道法已成为植物遗传 转化的有效途径。1花粉管通道法的起源与创立花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然的花 粉管通道(又叫花粉管引导组织),经珠心通道,将外源DNA携带入胚囊,转化受精卵或其前后 的生殖细胞(精子、卵子),由于它们仍处于未形成细胞壁的类似“原生质体”状态,并且正在进 行活跃的DNA复制、分离和重组,所以很容易将外源DNA片段整合到受体基因组中,以达到遗 传转化之目的。该方法可用于任何开花植物,将供体总DNA的片断,在受体自花授粉后一定时期 涂抹于柱头上,使能沿着花粉管通道进入胚囊,转化受精卵或其前后的细胞。实际应用时一般切除 柱头进行涂抹,这样可减少DNA进入胚囊的距离,提高转化率,但会影响结实率。该法的提出是 基于1980年Hess的实验,他报道了花粉粒可以吸收外源DNA的结果,是该技术的最早萌 芽。我国学者周光宇早在20世纪70年代就提出了在植物远缘杂交中存在着DNA片段杂交的假 说,是该技术的理论基础,据此设计了自花授粉后外源DNA导入植物的技术(王罡等,2002 )。1983年,周光宇教授成功地将外源海岛棉DNA导入陆地棉(Zhouetal.,19 83),培育出抗枯萎病的栽培品种,创立了花粉管通道法。2花粉管通道法的发展与应用Oht a(1986)报道应用外源DNA与玉米花粉混和授粉得到当代高频率的基因转移胚乳。Luo 和Wu(1988)用花粉管通道法将含报告基因的质粒DNA转入水稻,经Southern杂 交和酶学鉴定,都得到了转基因植株。使花粉管通道法的转化工作能够像其它直接转化法一样,完 全按转基因技术的操作进行。随后,谢道昕等(1991,中国科学B辑,21(4):367- 373)将2个Bt杀虫基因导入棉花品种中,后代经分子杂交证明杀虫基因已整合到棉花基因组 中,同时报告基因(GUS)也得到表达。曾君祉等(1993,中国科学B辑,23(3):2 56-262)利用花粉管通道法将报告基因、目的基因等转入小麦,经SouthernBlo t-ting、NorthernBlotting等方法鉴定和对表达产物进行检测,及对小麦 转基因植株后代连续4代遗传表现的观察,证明转入的外源基因可以稳定遗传,转化率为4.7% ,其遗传规律与其它转化方法,如农杆菌介导法、基因枪法等的结果相似。丁群星等(1993, 中国科学B辑,23(7):707-713)用子房注射将Bt基因导入玉米自交系,获得转基 因玉米(TO),经点杂交、Southern杂交及PCR扩增,均获阳性结果;D1代中有7 株的PCR扩增呈阳性结果。易地重复该试验,也获得了成功,说明该方法是可以重复的。阎新甫 等(1994)将抗白粉病大麦DNA通过花粉管途径直接导入感病的小麦品种“花76”中,他 们不仅获得了符合遗传规律的稳定抗病后代,而且还确定了抗白粉病是由一对显性基因控制。台湾 缪芳心等利用花粉管通道法,建立了甘蓝基因转育系统并通过外源总DNA的导入,将抗白粉病性 状导入甘蓝受体(李长缨和简元才,2000)。丁国华等(2000)采用花粉管通道技术将抗 赤星病烤烟CV87的总DNA导入感病烤烟NC89,筛选出DZ9811和QD9812在抗 病性和烟草品质上为优良植株。王罡等(2002)以玉米生产上骨干自交系为主,开展了花粉管 途径的转化工作,将Bt杀虫蛋白基因转入玉米自交系,利用花粉管通道技术将Bt抗虫基因导入 玉米,用PCR检测技术,从分子水平初步验证此项技术在玉米上应用的可行性,该方法避免利用 农杆菌介导或基因枪法导入目的基因难以得到再生植株的困难,节省人力、物力并获得大量的种子 。马盾等(2003)通过技术改良和方法创新,利用花粉管通道法进行棉花转基因,提高转基因 成功率,使其更好地为育种服务。余桂荣等(2004)以13个小麦品种的植株为受体材料,用 花粉管通道法进行了硫氧还蛋白反义基因的遗传转化。经PCR检测31个株系中有16个株系呈 阳性反应。至此,花粉管通道法已在多种作物中获得成功,确立了其在直接转化法中的地位,其中 我国科学工作者的贡献功不可磨。在我国首批批准释放大田的转基因作物中,中国农科院培育的具 有Bt杀虫蛋白基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的双价抗虫转基因棉花,正是利用花粉管通道法进 行转化,将表达载体转入我国栽培棉品种中获得成功的,经分子检测,证实了双价杀虫基因在棉花 基因组中的整合与表达(郭三堆等,1999)。由此可以证明,花粉管通道法可以用于基因表达 载体和总DNA等多种形态的遗传物质的转化。3花粉管通道法的机理研究与分子验证随着近代分 子生物学的进展和基因工程的出现,外源DNA可通过花粉管通道导入植物胚囊这一事实越来越多 地被许多学者所证实,同时也说明DNA片断杂交的存在。为了研究花粉管通道法导入外源基因的 机理,国内外学者先后进行了许多工作。上海中科院生化所与江苏省农科院经济作物所(翁坚等, 1984)应用缺口翻译法,以3H标记棉花DNA分子,于棉花授粉后24h从子房顶部注入, 在0.5~8h之间取样,放射自显影,可以观察到2~4h之间80%以上的胚囊均有3H-D NA。除从珠孔到胚囊间的花粉管通道外,珠心任何其它部分均无自显影斑点,进入胚囊的花粉管 内亦无同位素。证明花粉管珠心通道是外源DNA从珠孔到达胚囊的唯一途径。雷勃钧等(199 4,中国科学B辑,24(6):596-601)将外源高蛋白野生大豆总DNA直接导入栽培 大豆后对转化后代、受体、供体进行RAPD分析,从150个引物中找到24个引物检测出DN A的多态性,证明外源总DNA片断可以通过花粉管通道导入受体,引起基因组变异。李远新博士 对授粉后6~30h的黄瓜、西葫芦花粉管引导组织、花粉管的生长及胚珠的状态进行了研究,观 察结果表明,授粉后6h,随着少数花粉管进入子房顶部,子房顶部少数胚珠开始出现珠心通道开 放、花粉管进入珠心通道的现象。授粉后12h,子房前1/3处许多胚珠的珠心通道呈开放或半 开放状态。注入子房的外源DNA,顺着附近的引导组织,进入花粉管即将到达开放的珠心通道, 并随着花粉管进入胚囊。1990年Potrykus对受精过程的研究认为,在受体组织中,同 时具备再生感受态和转化感受态的细胞是转化成功的关键。当受精过程开始后,卵细胞发生急剧的 脱分化过程,形成合子后,彻底消除了以前的分化特性,变成核大、质浓和分裂活跃的细胞,具有 再生及转化感受态细胞的特点(曾君祉和李番,1993,小麦受精过程中花粉管入胚囊的研究, 见:余传隆,主编,生命科学进展——理论、技术、应用,pp.456-468)。亚显微结构 的观察揭示,在精子进入时,卵细胞的细胞壁还未形成,一些壁物质分散地聚集在细胞膜的表面, 似小岛状(Zhutetal.,1993;WillemseandvanWent,1984 )。因此这些卵细胞类似未完全酶解的原生质体,为外源基因的进入提供了可能性。黄国存等(1 998,科学通报,43(23):2531-2533)通过绿色荧光蛋白基因gfp,得到了 在紫外激发光下显示绿色荧光的棉花胚胎,证实了花粉管通道是外源基因进入胚囊实现遗传转化的 途径。邓德旺等(1999)采用激光共聚焦显微技术也验证了花粉管通道的可行性。观察到花粉 管从花柱进入中轴胎座时,需要经过一个折向,沿着中轴胎座的外周向下生长,在胚珠着生处折向 进入珠孔。4影响花粉管通道法导入外源基因的因素供体DNA片断的大小、DNA的纯度和浓度 、DNA导入时期等都会影响基因的导入。周光宇认为DNA片断的大小以不小于107Da为宜 。过小将有可能得不到带有完整基因的DNA片断,使DNA供体的性状无法表达。外源DNA直 接导入技术对DNA时段又可能有显著的差异。因此,充分考虑各影响因子、最佳导入时间间隔和 时间点还需因地因时而异(包劲松和李载龙,1996,浙江农业科学,(1):47-50)。 5花粉管通道法的优点及局限性向植物进行外源基因转化总体上可分为3个转化系统,即载体转化 系统、直接转化系统和种质转化系统。花粉管通道法属于种质转化系统,与载体转化系统和直接转 化系统相比,花粉管通道法有其独特的优势。此法可以应用于任何单胚珠、多胚珠的单子叶、双子 叶显花植物,只需了解其开花习性、花器构造及授粉受精过程和试验出注射外源DNA的最佳时间 ,即可应用(李长缨和简元才,2000)。此法可以任意选用生产上的优良品种,进行目的性状 基因转化,同时仍保持受体的优良性状。只有部分外源DNA片段进入受体基因组,基因纯合速度 快,一般在转化自交后3~4代就可稳定,性状纯合速度比有性杂交及其它转化法快。花粉管通道 法的应用还打破了种、属间的限制,所以可以在不同科、属、种的植物中广泛筛选育种资源,进行 更为远缘的杂交育种,培育新的烟草品种或创造新物种。这一技术省略了组织培养的过程,同其它 转基因技术相比,具有简单、方便、育种时间短、任何基因源都可用来基因转化,并可直接运用到 常规育种等优点。此法的局限性在于只能用于开花植物,且只有花期可以进行转育。导入总DNA片段的转育株会带有少量非目的性状的DNA片段。而且已有的研究结果表明,花粉管通道法介导的转基因后代仍可能产生变异。外源DNA导入花粉管通道技术的发展和应用@孔青$山东农业大学林学院!泰安,271018
@丰震$山东农业大学林学院!泰安,271018
@刘林$泰山医学院总务处!泰安,271000
@孔雨光$山东农业大学林
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