天然磷矿粉是磷肥的主要来源 ,可直接作为磷肥施用到酸性土壤 ,但碱性土壤的效果一般很差 ,如果接种某些溶磷微生物 ,也有较好的效果<1> 。即使施用可溶性磷肥 ,由于迅速转化为钙、铁、铝等多种难溶性磷酸盐 ,磷肥的利用效率一般都低于 2 5 %。近几年 ,我国磷肥的施用量不断增加 ,土壤出现明显的磷素富集 ,导致土壤养分不平衡 ,而且磷素流失污染水体。因此活化土壤磷素提高利用效率 ,对于农业生产和环境保护具有非常重要的意义<2 > 。微生物可促使磷矿粉分解 ,并释放出可溶性磷。Ghanietal<3> 利用硫杆菌产生的硫酸使磷矿粉中的磷释放出来 ,其可浸提磷比不处理增加 9～ 15倍。我们曾将微生物与磷矿粉一起进行固体发酵 ,发现可将磷矿粉中 3%左右的磷释放出来。利用生物溶解磷矿粉 ,生产具有生物活性的磷肥 ,不仅节省硫酸等工业原材料 ,而且还避免对环境的污染。研究表明 ,在为数众多的溶磷微生物中 ,曲霉的溶磷活性很高<4 > 。我们的研究也表明 ,曲霉不但有较强的溶解磷矿粉的活性 ,而且还有较强的溶解难溶性磷酸铝、磷酸铁的能力<5> 。本研究选择溶磷能力较强的一株曲霉 ,分析磷矿粉用量对其溶磷活力的影响 ,同时了解其溶磷的动态变化和原理 ,为进一步探讨微生物对磷矿粉施用的作用机理提供参考。1 材料与方法1.1 菌株为本研究室从土壤中分离得到的溶磷能力较强的曲霉Aspergillus 2TCiF2 <5> 。1.2 培养基1)菌株活化培养基 :PDA固体培养基。2 )摇瓶液体培养基 :蔗糖 10 .0g ,KNO30 .76g ,NaCl 0 .3g ,KCl 0 .3g ,MgSO4 ·7H2 O 0 .3g ,FeSO4 ·7H2 O 0 .0 3g ,MnSO4 ·4H2 O 0 .0 3g ,蒸馏水加至 1L ,pH7.0～ 7.5 ;
磷矿粉 (<0 .0 18mm)用量分别为 0、1、2、5、10、2 0和 5 0g·L- 1。1.3 磷矿粉用量对溶磷的影响将在PDA平板上培养 7d(2 8℃ )的曲霉 2TCiF2菌株制备成孢子悬浮液 (10 6 cfu·mL- 1) ,取 1mL接种于 5 0mL含不同质量浓度磷矿粉的液体培养基中 ,2 8℃下旋转振荡培养 (16 0r·min- 1) 7d后 ,将培养液过滤 ,测定菌体质量。滤液在 4℃下离心(9 0 0 0g) 2 0min ,测定上清液的含磷量和pH。同时做不接种对照。重复 4次。1.4 溶磷动态取 1mL孢子悬浮液 ,接种于 5 0mL液体培养基中 ,磷矿粉用量为 10g·L- 1,2 8℃下旋转振荡培养(16 0r·min- 1) 2 1d ,于 0、1、3、5、7、9、11、14、17和2 1d取样 ,将培养液过滤 ,测定菌体质量。滤液在4℃下离心 (90 0 0g) 2 0min ,测定上清液的含磷量、pH和有机酸种类及含量。同时做不接种对照。重复 4次。1.5 测定方法上清液磷含量用钼锑抗比色法测定 ,溶磷量为扣除对照值 ,用Pmg·L- 1表示 ,溶磷率为 10 0g磷矿粉所溶解出来的水溶性磷量。培养液的pH用pHS- 2 9A测定 ,有机酸用岛津LC - 10A高效液相色谱测定 (紫外检测器SPD - 10A ,柱箱CTO - 10A) ,色谱条件 :分析柱RP -ODS -C18;检测波长 2 14nm ;流动相为pH2 .2 3磷酸二氢钾缓冲液 ;流速 0 .7mL·min- 1;柱温 2 7℃。菌体质量用烘干法测定 ,先用滤纸过滤 ,并用蒸馏水冲洗 3次 ,于 80℃烘 8h ,冷却后称重 ,用mg·mL- 1表示。磷矿粉全磷含量 (P)用1∶1HNO3测定 ,为 10 .3% <6 > 。2 结果与讨论2 .1 磷矿粉用量对溶磷活性和菌体生长的影响磷矿粉用量对Aspergillus 2TCiF2的溶磷量影响显著 :低于 2 0g·L- 1时 ,溶磷量随着磷矿粉用量的增加而增多 ,峰值达 4 90mg·L- 1,继续增加磷矿粉到5 0g·L- 1时 ,其溶磷量逐渐降低到 4 0 0mg·L- 1左右。随着磷矿粉加入量的增加 ,溶磷率从磷矿粉用量为 <2g·L- 1时的 10 0 %降至 5 0g·L- 1时的 7%左右(图 1)。Narsian&Patel<4 > 也发现真菌Aspergillusaculeatus的溶磷量随着磷矿粉加入量的增加而降低 ,溶磷活性最高时的磷矿粉用量为P2 O50 .5g·L- 1。Aseaetal<7> 报道不同青霉菌株对培养基中磷矿粉用量的敏感程度不同 ,且与N源有关 :当以NH+4 为N源时 ,随着磷矿粉质量浓度的增加 ,Penicilliumbilaji溶磷活性降低 ,而Pencilliumfuscum溶磷活性增强 ;当以NO- 3为N源时 ,磷矿粉用量从 1g·L- 1增至 2g·L- 1时 ,溶磷活性增强。图 1 磷矿粉加入量对 2TCiF2溶解磷矿粉的影响Fig .1 Effectofrockphosphateadditiononphosphatesolubilizationby 2TCiF2 张永奎等<8> 报道磷矿粉用量超过 2 0g·L- 1时 ,由于氟浓度增加而抑制细菌Hst的生长 ,溶磷量大幅度降低。本研究发现菌体生长确实受到磷矿粉用量的影响 (图 2 ) ,磷矿粉用量低于 5g·L- 1时 ,随着磷矿粉用量增加 ,菌体生长量增加。说明当磷矿粉用量少时 ,菌体生长受缺磷的限制 ,当提高磷矿粉的用量时 ,菌体大量生长。但继续增加磷矿粉的用量直至 5 0g·L- 1时 ,菌体质量没有显著变化 ,说明菌株生长所需的磷已足够 ,而磷矿粉中其他成分也没有对Aspergillus 2TCiF2造成危害。赵小蓉等<9> 报道微生物的溶磷量与生长量没有直接关系 ,本研究也验证了这一结论。虽然当磷矿粉用量超过 2 0g·L- 1时 ,供试菌株的溶磷量大幅度降低 ,但其菌体生长量并没有发生显著的变化。图 2 磷矿粉加入量对 2TCiF2生长及pH的影响Fig .2 Effectofrockphosphateadditionon 2TCiF2growthandthemediumpH 磷矿粉的化学组成主要是Ca、Mg、Na、P、C、O和F等元素 ,CaO占 5 6 %左右。微生物在代谢过程中产生质子和有机酸等物质 ,通过交换、水解、络合、螯合等反应 ,使磷矿粉分解 ,释放出磷酸盐 ,同时也释放出钙、镁、钠等离子 ,其水解将使培养液的酸度降低。磷矿粉加入量从 1g·L- 1增至 2g·L- 1时 ,培养液的pH升高<8> 。本研究也得到类似的结果 ,培养液的pH值随着磷矿粉用量的增加而提高 ,超过 5g·L- 1时 ,培养液的pH值基本保持在 5左右 (图 2 )。2 .2 溶磷动态在培养开始 3d内 ,曲霉 2TCiF2生长非常缓慢 ,第 3天时菌体质量只有 0 .0 6mg·mL- 1,但第 5天骤增至 2 .4 9mg·mL- 1,以后不再生长。磷的释放在培养 3d后直线增加 ,第 14天时达到 6 31.2 1mg·L- 1,在此期间 ,每天的溶磷量为 74 .72mg·L- 1,以后的7d培养期间 ,几乎没有磷的释放 (图 3)。这说明该菌株的溶磷活性表现在 3～ 14d培养期间 ,在以后的培养期间 ,可能由于碳源物质耗竭 ,菌体不再生长繁殖。Mollaetal<10 > 对 9株细菌和 1株放线菌进行了 15d的培养 ,发现Bacillussp .等一些细菌的溶磷能力在 11d达到高峰 ,Streptomycessp .放线菌 15d后仍呈上升趋势。Illmer&Schinner<11> 也发现溶磷量不是平稳地上升 ,而是表现出明显的波动 ,微生物的溶磷能力与其生长并不完全吻合。图 3 曲霉 2TCiF2溶磷动态Fig.3 ThedynamicsofthephosphatesolubilizationcapacityofAspergillus 2TCiF2during 2 1dincubation 培养液的酸度也随培养时间而变化 ,并且基本上与菌体生长吻合。第 1天培养液的pH变化很小 ,第 3天降至 6 .2 4 ,第 5天降低到 3.5 9,以后基本不变(图 3)。菌体生长基本停止 ,菌体仍然在消耗和分泌有机酸 ,并且分泌有机酸的种类发生了巨大的变化。培养期间 ,菌体在不同生长阶段分泌的有机酸的种类和数量有明显变化 (图 3,表 1) ,有机酸总量随着培养时间的延续而增加 ,5d前主要产生柠檬酸和乙酸 ,但以后主要产生乙酸和苹果酸 ,尤其是乙酸的产生量在第 9天就达到 4 .5 2mmol·L- 1,虽然第11天又降低到 1.19mmol·L- 1,但以后又有所上升 ,培养结束时达到 6 .5 2mmol·L- 1。在此期间还产生其他有机酸 ,但数量很少。显然 ,菌株在培养期间因蔗糖的耗竭转而利用所分泌的有机酸 ,同时可能发生有机酸代谢的变化。Vassilevetal<12 > 发现在能源物质缺乏时 ,Aspergillusniger能够利用柠檬酸 ,Salle<13> 报道微生物能够利用简单的碳水化合物、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸和草酸。表 1 曲霉 2TCiF2分泌有机酸的种类及分泌量Table 1 ChangesinthenatureandquantityoforganicacidsproducedbyAspergillus 2TCiF2mmol·L-1培养时间 /d苹果酸乳酸乙酸顺丁烯二酸柠檬酸
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