人工种子是 Murashige于 1978年在国际园艺植物学术讨论会上首先提出的 <1 > ,它是指将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织 (芽、
愈伤组织、胚状体等 )包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。完整的人工种子包括体胚、人工胚乳和人工种皮。人工种子在本质上属于无性繁殖 ,与天然种子相比具有快速繁殖优良品种或杂种 ,对于利用杂种一代优势的作物 ,不需要三系或二系配套及其复杂的育种程序 ;对于自然条件下结实率低或难以用种子繁殖、育性欠佳的作物 ,可以大量地快速繁殖 ;人工种子内的培养物 (不定芽、胚状体等 )因通过组织培养而产生 ,繁殖速度快、生产周期短 ,能人工控制 ,特别对遗传工程创造出的新型物种 (如转基因植物或杂种 ) ,可用该项技术繁殖或保存。在人工种子的制作过程中还可加入多种生长调节剂、有益微生物、农药、除草剂等以提高品种的抗逆境能力 ;人工种子还具有节约种源 ,不占用土地 ,一年四季均可工厂化生产的特点 ,深受世界各国重视。Kitto等用聚氧乙烯包裹胡萝卜胚状体于 1981年首次制成了人工种子<2 > ,我国于 1995年首次制成了特种稻的人工种子<3> 。欧洲把三倍体西红柿人工种子的研制列入尤里卡计划 ,我国将其列入国家86 3计划 <4 >。经过 2 0余年的研究 ,人工种子的研究取得了很大进展 ,并已能在有菌条件下发芽成苗或用于大田和温室生产的报道 <4 ,5>。1 人工种子的研究现状早期的人工种子研究仅限于胡萝卜、苜蓿、芹菜等模式作物 <1 ,6～ 1 1 > ,当时包埋的材料仅胚状体 ;而目前研究范围己转向水稻、甘薯、棉花等具重要经济价值的粮食作物 ,包埋材料除用胚状体外还有胚类似物 <1 2 > ,即用芽、短枝、愈伤组织、花粉胚等 ,用这类材料包埋的人工种子变异小、萌发率和成苗率高 <1 3>。如以腋芽为材料进行人工种子研究的作物有烟草和花叶芋<1 4> 、蕹菜 (移栽存活率达 10 0 % ) <7,1 5～ 1 7> 、桑树 (转化率6 3% ) <1 8,1 9>、姜 (转化率 81.8% ) <2 0 >、香蕉 (在培养基、湿棉花、滤纸及土壤中的转化率分别为 10 0 %、38%、35 %和 10 % ) <2 1 >、甘薯 (萌发率 6 0 %以上 ) <2 2 >等。也有用毛状根为培养物制作人工种子的研究 <1 3> 。即发根农杆菌感染植株时 ,由于其 Ri质粒(root inducing plasmid)上的 T- DNA基因整合到植物细胞基因组中 ,在植株伤口诱导产生的具多分枝、多根毛、无向地性、能在无外源激素的培养基上快速生长不定根的研究。因此 ,人工种子在快速繁殖无性系、固定杂种优势及与基因工程相结合等方面有着广阔的应用前景 <2 3> 。1.1 人工种子的包埋Redenbaugh于 1984年首次筛选出透水性好的海藻酸钠作为胚状体和不定芽的包埋剂 <6 >。包埋方法主要有将胚状体或小植株悬浮在一种粘滞的流体胶中直接播入土壤的液胶包埋法 <2 4 > ,Drew用此法将大量的胡萝卜体细胞胚放在无糖而有营养的基质上包埋获得成功<2 5> ;还有将体细胞胚经干燥后用聚氧乙烯等聚合物进行包埋的干燥包裹法 <1 2 > ,以及通过离子交换或温度突变形成凝胶包裹材料的水凝胶法 ,Redenbaugh等用此法包裹单个苜蓿体细胞胚制成了人工种子 <6 > ,离体成株率达 86 %。组合包埋法以及流体播种、液胶包埋、琼脂、铝胶囊等新颖包埋法也开始被应用 <1 2 > ,George等用硅胶包埋谷子体细胞胚 <2 6 > ,葫发率达 82 % ,且 4℃贮藏 14天后仍能自行裂开、顺利萌发。1.2 人工胚乳的制作海藻酸钠作为人工胚乳具有无毒、资源 丰富、价廉及工艺简单等特点被广泛应用于人工胚乳的制作尚存在着营养物质易渗漏、透性差而阻 碍体细胞胚的生长、胶粒易失水变干及失水后的吸水回胀率低、胶粒本身带有粘性和不便于贮存、运输和播种等问题。选用无毒、透气和吸水性强的木薯淀粉与1.5 %
海藻酸钠 (1/ 2 MS培养基配制 )混合制作的胚乳可改善单一海藻酸钠人工胚乳的透气性、吸水性和发芽率<2 7> ,人工胚乳中加入 GA3有利于人工种子的发芽 ,加入 Ca Cl2 有利于向培养物供氧 ,提高人工种子发芽率和耐贮藏性<4 > ,加扩活性炭可改善营养固定和缓释 <2 8> ,提高人工种子在土壤中的成苗率 <2 9>。因此 ,用激素 (GA3等 )、缓释物 (活性炭等 )、固化剂 (Ca Cl2等 )、抗生素及其它混合物 (木薯淀粉等 )制作全能性人工胚乳将是今后发展的目标。1.3 人工种皮的制作人工种皮一直是人工种子研究的主要热点之一。 Gray等认为应改进包埋基质来提高人工种皮的性能 <30 > ,Kitto等在 8种水溶性树脂中筛选出聚氧乙烯。现已筛选出海藻酸钠、明胶、果胶酸钠、琼脂、树胶等可作内种皮应用<6 ,30 > ,某些纤维素衍生物与海藻酸钠制成复合改性的包埋基质可明显改善人工种皮的透气性 <32 > ,海藻酸钠中加入多糖、树胶等可减慢凝胶的脱水速度 ,提高干化体细胞胚的活力 <33,34 >。日本麒麟啤酒公司和美国植物遗传公司联合研制出一种新的包埋胶体 ,能在一定条件下自行裂开 ,顺利萌发<35> 。为解决单一内种皮存在的诸多问题 ,人们又着手外种皮的研究。L ing- Fong Tay用壳聚糖作为外种皮制作的油菜人工种子萌发率达 10 0 % <36 > ,但在有菌条件下萌发率仍不高。 Reden-baugh等采用 Elvex TM4 2 6 0作为外种皮制作的人工种子可用播种机播种 ,发芽率达 80 % <6 > 。人们仍在积极寻找其他的包埋方式和包埋材料 ,以完善现有人工种皮的制作技术1.4 人工种子的贮藏贮藏是人工种子的主要难点之一 ,目前应用的有低温法、干燥法、抑制法、液体石蜡法等及上述方法的组合 <37>。干燥法和低温法组合是目前应用最多的 ,胡萝卜愈伤组织在 15℃相对湿度 2 5 %的条件下存放一年仍可再生。大豆体胚干化到原体积的 4 0 %～ 5 0 %后再吸水 ,萌发率仍达到 31% <38> 。干化增强人工种子幼苗的活力 <39,4 0 > ,可能与其超氧化物酶和过氧化物酶的活性显著提高 ,从而减轻低温贮藏对体胚的伤害有关<35> 。通过电镜观察和电导值与脱氢酶的比较 ,发现干化有助于体胚贮藏期间细胞结构、膜系统的保持和酶活性的提高 ,使体胚具有更好的耐贮性 <4 1 > 。富含胡萝卜体胚的悬浮培养液包埋于水溶性塑料薄膜内 ,形成的胶囊 2 6℃干化 4天后再吸水萌发仍可获得植株 <4 2 > ,高浓度的蔗糖、脯氨酸和 ABA预处理体胚能提高干化耐受性<2 0 ,33,4 2～ 4 4> ,这可能与 ABA等抑制体胚过早萌发、促进干物质积累有关<4 6 > 。近年 ,液氮冻存体胚及包裹体胚的报道也越较多 <4 3,4 6 >。防腐是人工种子贮藏和大面积田间应用的关键技术之一。Castillo制得的人工种子虽有较高的萌发率 ,但未能在有菌条件下成苗 <4 7> ,其主要原因是人工种子易感染病菌而腐烂。在甘薯人工种皮中加 4 0 0～ 5 0 0 mg/L 的先锋霉素、多菌灵、安苄青霉素或羟基苯酸丙酯 ,均有不同程度的抑菌作用 ,萌发率可提高 4 %～ 10 % <7> 。2 几种作物人工种子的研制2 .1 水稻人工种子的研制水稻人工种子大多是通过体细胞胚方式包埋而成的 ,秦瑞珍等 1989年首次报道了通过不定芽再生的水稻植株 <4 8>。用水稻不定芽无性繁殖系制作人工种子的方法是 :剥去稻种颖壳的糙米 ,2 μg/ml2 ,4 - D溶液浸泡过夜 ,洗涤精和自来水反复冲洗后 ,0 .1%升汞灭菌 15～ 2 0分钟 ,无菌水冲洗数遍后将米粒接种在 MS+2 μ/ml2 ,4 - D+0 .5 μg/ml KT诱导培养基上 ,2 5℃暗培养。 2天后胚芽出现 ,7天后胚芽基部开始膨大 ,切除胚芽后继续培养 ,2 5天后胚性愈伤组织出现 ,然后将其移至含 1μg/ml IAA+0 .5μg/ml 6 - BA的 MS培养基上 ,可分化出绿苗。 1个月后 ,将绿苗的顶端切除 ,置于 MS+3μg/ml 6 - BA+0 .2μg/ml NAA增殖培养基上 ,待苗长高后再切除顶部 ,如此反复继代即可筛选出不定芽进行包埋、制作人工种子 <4 9> ,但该法尚存在着不定芽的变异问题。用水稻幼穗也可制作人工种子 ,其方法是 :取 1cm左右的水稻幼穗 ,70 %乙醇表面消毒 1分钟 ,在超净台上剥开、接种于含 1mg/L 2 ,4 - D、0 .5 mg/L BAP、30 g/蔗糖、6 .8g/L 琼脂、p H值 5 .8的 N6 培养基上 ,2 6± 2℃暗培养。将诱导出的愈伤组织接种于含 2 mg/L BAP、0 .2 mg/L 2 ,4 - D、4 5 g/L蔗糖、7g/L琼脂、p H值 5 .8的 N6 培养基上 ,2 6± 2℃光培养 ,光强 15 0 0 lux。将分化的 2～ 3mm不定芽置于含 2 %海藻酸钠、铜盐、10 0 mg/L肌醇、2 mg/L BAP、0 .5 mg/L NAA、碳源为麦芽糖的 N6 培养基的凝胶液中 ,在无菌条件下将含有不定芽凝胶滴入 Ca Cl2溶液中固化成直径为 6 mm的水稻人工种子 <1 7> 。2 .2 棉花人工种子的研制取硫酸脱绒的棉花成熟种子 ,70 %乙醇消毒 2分钟 ,在火焰上灼烧片
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