前言： PCR技术是基于天然DNA复制的原理,人们独创构思设计的一种体外进行的模拟生理条件下特异 性DNA靶序列扩增的方法，这一技术方法能够选择性地富集某一特异性DNA靶序列。PCR技 术，又称无细胞分子克隆系统,或者称为特异性DNA靶序列离体条件下引物定向酶促扩增法，PCR技术的反应体系由模板DNA靶序列、DNA引物、4种dNTP、Mg(++)、反应缓冲液及耐热DNA聚合酶组成。PCR技术的反应循环由三个步骤构成,即⒈模板DNA靶序列变性 ⒉引物与模板DNA链结合 ⒊引物链延伸合成新的模板DNA链,即模板DNA靶序列得以复制。这样由以上三个步骤组成了P CR技术的一次循环扩增反应,反复进行若干次这样的循环扩增反应，模板DNA靶序列的拷贝数便呈指数性倍数增加。
⒈ 典型PCR技术的反应条件
在PCR技术的反应体系中，由含有DNA靶序列的基因组片段作为模板，由两条与模板DNA靶序列正、负链末端互补的寡聚核苷酸链作为引物，耐热DNA聚合酶目前采用Taq 聚合酶，反应缓冲液采用Tris-HCl缓冲液系统。
在PCR技术的循环扩增反应步骤中，模板DNA靶序列的变性温度一般为90～95℃的高温，在 此温度下，模板DNA靶序列的DNA双链解旋,形成单链；引物与模板单链的结合温度通常为5 0℃，此时,引物链与模板单链的特定部位通过碱基互补的氢键作用互相结合；引物链延伸合成新的模板单链,都是在生理温度条件下,即37℃，由Taq聚合酶催化底物4种dNTP发生聚会反应,从而合成新的模板单链，至此完成一次模板DNA靶序 列的PCR循环扩增反应。假定，模板DNA靶序列的起始浓度为1，经过n次循环扩增反应后,该模板DNA靶序列的最终浓度则为
n
(1＋X) －nX－1，其中X为PCR循环扩增反应中平均有效循环扩增率。
在PCR循环扩增反应的过程中，随着引物、底物的不断消耗以及反应产物的逐渐累积，由Taq 聚合酶催化的酶促反应逐步趋于饱和，达到酶促反应的“平台期”，此时 ，酶促反应效率明显下降，不再呈指数性上升。PCR循环扩增反应达到酶促反应的“平台期”所需的循环扩增数n ，与PCR循环扩增反应中平均有效循环扩增率X、耐热DNA聚合酶目前采用种类、PCR循环扩增反应中反应底物4种dNTP的起始浓度有关。一般PCR循环扩增反应的循环扩增数n 都在30左右，因此PCR循环扩增反应的循环扩增次数并非可以无限次地增加。
对于模板DNA靶序列的PCR循环扩增产物可以采用多种方法进行检测鉴定，通常采用琼脂糖凝胶 电泳技术，或者采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，经过溴化乙锭（EB）染色，在波长为253.7 nm的紫外光下,检测荧光条带；有时如有必要,也可以采用同位素标记的特异性DNA分子探针进行核酸分子杂交鉴定，也可以采用微板核酸杂交－ELISA等技术方法进行检测鉴定。
在PCR循环扩增反应的过程中，引物序列的设计与合成甚为关键。通常在感兴趣的某特定DNA片 段的两端，即模板DNA靶序列的两端，设计一对引物，该引物按照碱基配对法则，严格地与模板DNA靶序列正、负链的两端互补，在Taq聚合酶催化的酶促反应作用下,引物链沿着模板DNA靶序列链从5′端向3′端延伸合成新的模板 DNA靶序列链。引物链的长度一般为15～30bp，为保障引物链在PCR循环扩增反应过程 中特异性的稳定,在引物序列的设计中通常选择模板DNA靶序列链中鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）的含量在50%左右的区域。
⒉ PCR循环扩增反应条件的选择与标准化方案 自从1985年美国Cetus公司人类遗传部的Saiki等人首次报道DNA聚合酶链式反应（ PCR技术）以来，PCR技术已经对生命科学相关领域的研究发展产生了深刻的影响，并且可望 对各种病原体做到高度敏感、高度特异地检测。具体PCR技术操作的成败，取决于一系列相关因 素的相互作用，在PCR循环扩增反应的过程中，加入的每一种成份和混合物都可能对其他成份产 生直接或间接的影响，而且由于PCR循环扩增反应是一个循环过程，每一次循环的循环扩增效率 ，哪怕是极其微小的变化，都可能会导致PCR循环扩增反应的终极产物发生很大的差异，因此分 析影响PCR循环扩增反应的各种因素，使其技术操作方案达到标准化与最优化，选择适宜的反应 条件，具有非常重要的理论意义与实践价值，特别是当PCR循环扩增反应作为病原体的诊断与鉴定技术应用时，尤其如此。
通过许多学者与研究人员的理论思考和具体实验，迄今已经对PCR技术创立早期的技术操作方案进行了许多改进与发展。
2.1 PCR循环扩增反应待扩增样品的制备 待扩增样品的制备，是PCR循环扩增反应技术操作中最棘手而有待于标准化的步骤之一。样品材料 的处理和保存决定着被分离DNA的质量,因而在很大程度上影响着PCR循环扩增反应的成败和检测结果的可重复性。
外周血单核细胞（PBMC）是PCR循环扩增反应应用较为成功的检测材料,而且这种检测材料易 于获得。如PCR循环扩增反应的实验由1000个细胞开始，便可采用一种简单的含去污剂的缓 冲液对检测材料进行处理,即1%十二烷基磺酸钠（SDS）缓冲液,或者非离子型NP-40/ Tween-20混合物缓冲液。但是如果PCR循环扩增反应的实验起始细胞数大于1000, 则必须用蛋白酶K进行消化处理，因为未经过消化处理的细胞碎片会缠绕DNA，或者直接抑制D NA进行PCR循环扩增反应。如果用全血进行PCR循环扩增反应的实验，则最困难的问题是如何有效地去除血红蛋白。
2.2 引物序列的设计与纯化选择
在PCR循环扩增反应中，引物序列的设计是确定PCR循环扩增产物序列的长度与位置的主要因素 ，引物序列的质量决定着PCR循环扩增反应的敏感性和特异性。因此,在设计与纯化选择新的引物序列时,应该注意以下事项:
①在引物序列的设计中，G、C含量宜接近被扩增的模板序列，以接近50%为佳,但是也应避免引物序列中含有较长的聚嘧啶或者聚嘌呤片段。
②在引物序列的设计中，应避免引物序列中含有可能产生次级结构的核苷酸序列。
③在引物序列的设计中，应该注意核对两个引物序列之间的碱基是否互补，尤其是在3′端，否则容 易生成引物序列二倍体,这是PCR循环扩增反应中常见的副产物。如果PCR循环扩增反应中出现了引物序列二倍体的情况,则可以采用降低引物序列浓度以及降低Taq聚合酶浓度的措施来加以克服。
④引物序列的长度一般为18～25个核苷酸（n）,通常在其5′端附加有一段不与模板序列互补 的DNA片段，例如，促进子、启动子或者限制性位点等。有时,引物序列在PCR循环扩增反应 中不起作用，原因不明，遇到这种情况时,可以采用通过移动复制位点的方法加以解决。一般情况 下，采用18bp长度的引物序列，就可以获得较好的PCR循环扩增反应结果，因为这一长度的 核苷酸序列在每一个人类基因组中通常只出现一次。同时,引物序列的长度一般也不宜超过25bp，否则，引物序列与模板序列进行的核酸分子杂交反应时间太久。
⑤引物序列的解链温度（Tm）必须设计的足够高，以确保在≥40℃温度时,能够有稳定的核酸分子杂交反应体系，并且能够确保在70℃进行Taq 聚合酶催化的DNA聚合反应时保持核酸分子杂交反应体系的稳定。
⑥一般情况下，采用100～300bp长度的模板序列，就可以获得较好的PCR循环扩增反应结 果，取得最佳的PCR循环扩增效率，所以,如果以诊断疾病病原体为目的进行PCR循环扩增反应，那么在设计引物序列时，就应考虑两个引物序列间相距不宜超过100～300bp。
⑦在引物序列的设计中，引物序列3′端应该选定在氨基酸密码子的第一个或者第二个核苷酸上，因为它们比氨基酸密码子的第三个摆动碱基更为保守。
⑧对于引物序列的纯化选择，通常采用高效液相色谱（HPLC）技术或者凝胶电泳技术，来纯化所有设计合成的引物序列，以确保它们以最高的可靠性和重复性参与PCR循环扩增反应。
2.3 Taq 聚合酶
在PCR循环扩增反应中，DNA耐热聚合酶的应用是关系到PCR循环扩增反应成败的关键因素。 在1985年美国Cetus公司人类遗传部的Saiki等人创立PCR循环扩增反应技术的最初阶段，PCR循环扩增反应技术采用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段,由于该片段在90℃下会发生蛋白质变性丧失酶活力，不能耐受PCR循环扩增反应技术操 作过程中变性反应的高温过程，因而每次PCR技术的循环扩增都需要添加新的大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow 大片段，这样就给PCR的技术操作程序带来了不少困难；同时由于该酶缺乏校正活性，使得在37 ℃下进行的酶促扩增反应容易发生引物链与模板之间的碱基错配，从而导致PCR循环扩增反应的 反应产物的特异性较差。因此，在PCR循环扩增反应技术创立的早期最初阶段，由于大肠杆菌D NA聚合酶Ⅰ的Klenow片段存在的上述问题，致使PCR技术的应用与发展受到了一定的限制，几乎陷入绝境之中。
为了解决能够耐受高温的DNA聚合酶这一PCR技术中的关键问题，人们大胆设想，自然界中存在 不少能够耐受高温的生物，其中包括大量的耐热细菌，这些生物必然是利用能够耐热的DNA聚合 酶来复制它们自身的DNA序列，进行繁殖传代。按照这一科学的逻辑推理，人们由自然界中能够耐受高温的生物群落分离择优到了DNA耐热聚合酶─Taq聚合酶,Taq 聚合酶的采用使得PCR循环扩增反应技术向着自动化、实用化方向的发展跨越了历史性的一大步,同时也使得PCR循环扩增反应技术的自身发展发生了质的飞跃。
Taq 聚合酶是由水栖高温细菌（thermus S qutious）Y11 菌株中分离得到的，该菌是1969年由Brock自美国黄石国家公园的温泉中分离出来的,其最适生长温度为70～75℃。Taq 聚合酶是分子量为60～68KDa、比活性为2000～8000U/mg的DNA耐热聚合酶， 其最大特点就是能够耐受高温，其最适酶促反应温度在70～75℃，但在37℃时仍能够保持较高的活性，对于90～94℃的高温也具有较强的耐受性。目前，Taq聚合酶已经采用基因重组技术进行商业化生产，其商品名称为 Ampli Taq 。
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