大量实验证明 ,多种肿瘤的生成、转移、复发和预后均与肿瘤血管生成密切相关<1 ,2 > 。因此 ,以肿瘤血管生成为靶点 ,开发血管生成抑制剂在抗肿瘤研究中是一个新的十分活跃的研究领域。抗疟药青蒿琥酯 (artesunate)是倍半萜内酯类化合物青蒿素(artemisinin)的水溶性衍生物 ,为二氢青蒿素 (dihy droartemisinin)的 1 2 α 琥珀酸酯钠 ,临床上用于抢救和治疗脑型疟疾和恶性疟疾。近年来 ,青蒿琥酯的抗肿瘤作用已引起重视 ,但尚未见在抗血管生成方面的报道。本文采用鸡胚绒毛尿囊膜 (chorioallantoicmembrane,CAM)、大鼠主动脉环无血清培养、人脐静脉内皮细胞 (humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)损伤迁移等实验 ,探讨青蒿琥酯抑制新生血管增殖与迁移作用 ,为进一步分析青蒿琥酯抗血管生成作用的机制提供依据。1 材料与方法1 .1 药物、试剂与动物青蒿琥酯 ,广西桂林第二制药厂 ;
氢化可的松(hydrocortisone)扬州制药有限公司 ;0 .5 %甲基纤维素、RPMI 1 640培养介质、DMEM培养介质 ,Gibco产品 ;纤维蛋白原 (fibrinogen)、牛凝血酶 (bovinethrom bin)、ε 氨基己酸 (ε aminocaproicacid)、MCDB 1 31、MTT,Sigma产品 ;胎牛血清 ,杭州四季青生物技术研究所。北京白鸡种蛋(杭州常青名鸡养殖场 ) ;2～3周龄 1 0 0～1 50g雄性Wistar大鼠(浙江省药物检验所 )。1 .2 鸡胚绒毛尿囊膜血管生成检测参考付生法等<3 > 方法加以改进。将孵化 7d的鸡胚 ,在近气室处开 0 .5cm× 1 .0cm窗 ,置孵箱内稳定 2 4h之后 ,将药物 甲基纤维素薄片放置于窗口CAM上 ,远离已形成的致密血管网。以 0 .3%NaHCO3 为溶剂对照 ,氢化可的松每胚 30 μg为阳性对照 ,加入不同剂量的青蒿琥酯 ,48h后 ,照相记录结果。并以给药点为中心 ,解剖显微镜下常规计数周围 5mm内的大、小血管。1 .3 动脉体外培养及血管生成检测取大鼠胸主动脉 ,切成 1mm长的主动脉环 ,按照Nicosia等<4> 的方法并略加改进。即将 1 .2mg的纤维蛋白原和 0 .5U的牛凝血酶溶于无血清培养液MCDB 1 31 ,加于 2 4孔板 ,待形成凝胶后 ,放入动脉环 ,再加入纤维蛋白原和牛凝血酶 ,使成凝胶 ,以固定新生血管。加入培养液MCDB 1 31 1mL及ε 氨基己酸。 72h第 1次换液 ,以后每隔 48h换液 1次。前 2次换液时同时分别给予二甲亚砜 (DMSO)每孔1 2 μL(空白对照组 ) ,氢化可的松每孔 1 2 μg(阳性对照组 ) ,青蒿琥酯每孔 6或 1 2 μg。每日在倒置显微镜下观察新生血管生长情况 ,并计数新生血管数目 ,拍照片记录。1 .4 人脐静脉内皮细胞的原代培养新鲜人脐静脉取自浙江省妇女保健院。将脐带剪成约 2 0cm长 ,用磷酸盐缓冲液 (PBS)洗 3遍 ,将0 .2 5%胰酶加入脐静脉中 ,于室温消化 30min ,抽出消化液 ,用血清终止反应 ,离心后用含 1 0 %胎牛血清的DMEM重悬细胞 ,置 37℃ ,5 %CO2 培养箱培养。1 .5 MTT法检测人脐静脉内皮细胞活性将HUVEC悬浮液加入 2 4孔板 ,每孔 5× 1 0 4个细胞。2 4h后 ,加入不同浓度的青蒿琥酯 ,37℃ ,5 %CO2 培养箱培养 48h ,加入 5g·L-1 的MTT ,继续培养 4h ,弃去上清夜 ,每孔加入 1 0 0 μLDMSO。振荡溶解 ,用酶标仪在 570nm波长下测定吸光度(A570nm)值。细胞增殖抑制率 (% ) =〔1 - (实验组A570nm/对照组A570nm)〕× 1 0 0 %。1 .6 人脐静脉内皮细胞损伤后迁移的测定用刀片损伤生长在 35mm塑料培养皿中已融合为单层的HUVEC ,用PBS冲洗 3次 ,加入含 1 5 %小牛血清的DMEM培养液 ,然后加入不同浓度的青蒿琥酯 ,置 5 %CO2 ,37℃培养箱中 ,2 4h后 ,在倒置显微镜下 ,从受伤边缘起连续计数 50 0 μm× 2 50 μm区段中迁移的内皮细胞数 ,数值表示 1 0个随机视野内的细胞数均值。1 .7 统计学处理所有数据均以 x±s表示 ,采用SPSS统计程序 ,多组间应用方差分析进行样本间比较 ,两样本均数间显著性检验用t检验。2 结果2 .1 青蒿琥酯对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响溶剂对照组的血管密度、分支明显多于青蒿琥酯组 ,管径也较青蒿琥酯组粗 (图 1 ) ,给予高浓度青蒿琥酯时 ,CAM只见极少数管径变细的大血管 ,细小血管明显减少。甚至出现溶血现象 ,个别鸡胚死亡。解剖显微镜下观察并计数给药点周围 5mm内的大、小血管 ,不同剂量组及与对照组间大血管数无明显差异 (P >0 .0 5) ,而各青蒿琥酯组微血管则较溶剂对照组显著性减少。
青蒿琥酯 60 ,30 μg组的CAM血管抑制作用明显 >30 μg氢化可的松组 (表1 )。Tab 1 . EffectofartesunateonnumberofvesselsinchickchorioallantoicmembraneDrug/ μgpereggNo .ofmainvesselsNo .ofmicrovessels0 .3 %NaHCO3 5.0± 1.0 40 .6± 2 .3Artesunate 154.2± 1.12 7.1± 8.5 ## 3 0 3 .8± 0 .99.7± 2 .7 ## 60 3 .2± 0 .73 .8± 1.6 ##Hydrocortisone 3 0 3 .6± 0 .919.5± 5.6 SeeFig 1fordrugtreatments .Thenumberofvesselswerecountedintheareaof 5mm diameteraroundtheinjectionpoint . x±s,n =16. P <0 .0 1,comparedwithNaHCO3 group ;##P <0 .0 1,comparedwithhydrocortisonegroup .Fig1 . Effectofartesunateonangiogenesisinchickcho rioallantoicmembrane.Chickchorioallantoicmembraneond7wasincubatedwithartesunateatdifferentconcentrationsfor 48handobservedthemorphologyofvesselsgrowth .(A) 0 .3 %NaHCO3 ;(B)hydrocortisone 3 0 μgperegg ;(C ,D ,E)artesunate 15,3 0 ,60 μgperegg ,respectivel2.2 青蒿琥酯对大鼠主动脉环血管生成的影响正常对照组微血管于培养d 3起有新生血管生成 ,7～ 1 3d新生血管迅速增多 ;1 4d后血管生成减慢 ,并逐渐减少。氢化可的松组微血管生成的时间规律与正常对照组相似 ,但生成的血管数较少。青蒿琥酯组的血管数明显少于正常对照组和氢化可的松组 ,且血管新生明显滞后 ,青蒿琥酯 6和 1 2 μg组分别于 7和 1 0d才有新生血管生成 (图 2 ,3)。Fig 2 . Microvasculargrowthcurvesofculturedrataortainfibringelinserum freeMCDB 1 31 .Artesunate6or 12 μgperwellwasaddedinthecultureswithaorticringex plantsatd 3andd 5(↓ ) . x±s.n =8. P <0 .0 5,comparedwithcontrolgroup (DMSO) ;#P <0 .0 5,comparedwithhydrocor tisone 12 μggroup .2 .3 青蒿琥酯对人脐静脉内皮细胞增殖活性的影响青蒿琥酯浓度为每孔 2 μg时 ,HUVEC的增殖抑制率为 3 .3 % ,无显著性差异 (P >0 .0 5) ;当浓度为每孔 5μg时对HUVEC有明显的增殖抑制作用 ;当浓度为每孔 2 0 μg时抑制率可达 90 .1 %。结果显示青蒿琥酯对HUVEC增殖有抑制作用 ,且呈浓度依赖性。IC50 值为每孔(1 1 .4± 3.8) μg(表 2 )。Tab 2 . Inhibitoryeffectofartesunateonprolifera tionofhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC)Drug/μgperwell A5 70nm Inhibitoryrate/%DMSO 0 .71± 0 .0 50 Artesunate 2 0 .70± 0 .0 4 3 .3± 4.1 50 .59± 0 .0 3 16.9± 3 .9 10 0 .42± 0 .0 3 4 1.4± 4.4 150 .2 3± 0 .0 3 67.1± 3 .7 2 0 0 .0 7± 0 .0 2 90 .1± 2 .8 HUVECwereplat
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