眼镜王蛇毒中含有丰富的酸性磷脂酶A2 (acidicphospholipaseA2 ,APLA2 )资源 ,从对不同产地的眼镜王蛇蛇毒中分离纯化得到的APLA2 的研究表明 ,它们都具有显著的抑制血小板聚集的作用 ,并且毒性较低<1～ 3 > ,提示眼镜王蛇毒的APLA2 在防治血栓疾病方面具有潜在应用价值。因此研究它们对各种动物血栓模型的作用 ,对于评价眼镜王蛇毒APLA2 的应用前景具有重要意义。其他蛇毒APLA2 抗血栓作用方面的研究已有报道 ,如尖吻蝮蛇毒的APLA2对动静脉搭桥血栓形成具有抑制作用<4> ,但眼镜王蛇毒的APLA2 对血栓形成的影响尚未见研究报道。作者曾经从广东眼镜王蛇毒中分离纯化出一种APLA2 ,因为是从Ⅰ峰中纯化得到的 ,因而命名为APLA2 Ⅰ ,并研究了它的部分生化性质和抑制血小板聚集作用<3 > 。
三氯化铁 (FeCl3 )诱导的血栓模型是血管内皮损伤引起的混合型血栓模型 ,与临床的动脉血栓较接近 ,实验中腹主动脉压的连续监测可作为血栓形成程度判断的简单易行的敏感指标 ,国外已用作抗血栓药物如阿司匹林、水蛭素等的研究<5> 。本研究通过观察APLA2 Ⅰ对FeCl3 诱导的大鼠腹主动脉血栓模型的影响 ,以验证其抗血栓形成的作用。1 材料和方法1 .1 动物与试剂Sprague Dawley (SD)
大鼠 ,♂ ,体重 2 80～ 32 0g,广东省医学实验动物管理委员会 2 6 2 0 0 2A0 0 3。NIH小鼠 ,♂ ,体重 1 8～ 2 2g ,广东省医学实验动物管理委员会 2 6 2 0 0 2A0 0 1。广东眼镜王蛇 (Ophiophagushannah)蛇毒采自广州市茶山蛇场 ,冷冻真空干燥后为黄色粉末。APLA2 Ⅰ由本室从广东眼镜王蛇毒中分离、纯化的单一组分<3 > ,用磷酸盐缓冲液 (PBS ,组成成分g·L-1 :NaCl 8.0 0 ,KCl 0 .2 0 ,Na2 HPO4·H2 O 1 .56和KH2 PO40 .2 0 )溶解成 1g·L-1 备用。阿司匹林肠溶片 ,购自恩华药业集团徐州制药厂 ,用PBS溶解 ,离心 ,取上清液 ,配成 1 0g·L-1 备用。牛凝血酶 (Sig ma)用蒸馏水配成 50kU·L-1 备用。人纤维蛋白原(中国医学科学院天津血液学研究所 ) ,用PBS配成1g·L-1 备用。1 .2 FeCl3 诱导大鼠腹主动脉血栓形成模型按文献建立FeCl3 血栓模型<6> 。 60只♂SD大鼠随机分为 6组 ,每组 1 0只。各组大鼠均麻醉后剖腹 ,分离左髂动脉并插管 ,经压力换能器与PcLab生物信号采集处理系统相连 ,连续监测腹主动脉压力 ;再分离左右肾动脉之间的腹主动脉段 ,放入 0 .6cm宽的封口胶条 (AmericanNationalCan产品 )备用。然后 ,给药处理如下 :假手术组舌下ivPBS ,30min后 ,在分离备用的腹主动脉段环抱浸透PBS的滤纸条 ;模型组舌下ivPBS ,阿司匹林组舌下iv阿司匹林1 0 .0mg·kg-1 ,APLA2 Ⅰ治疗组 3组分别舌下ivAPLA2 Ⅰ 1 .0 ,0 .5和 0 .1mg·kg-1 ,后 5组给药 30min后 ,均在分离备用的腹主动脉段环抱浸透 40 %FeCl3 溶液的滤纸条 (1 .0cm× 0 .5cm) ,并用预置的封口胶条封住。从腹主动脉环抱上滤纸条起观察其远心端腹主动脉压变化 ,反映血栓形成情况 ,连续监测 90min。记录初始腹主动脉压和最低腹主动脉压 ,从给腹主动脉环抱滤纸条至腹主动脉压降至最低所需的时间即为血栓形成时间。用游标卡尺在滤纸环抱处精确截取 0 .5cm长血管段 ,称重 ,取出血栓后的血管再称重 ,前后两者相减即为该 0 .5cm长血管段内血栓的重量<5> 。截剩的该部位腹主动脉段用PBS冲洗 ,放入 1 0 %甲醛固定 ,按常规石蜡包埋 ,横切片 ,HE染色。QWin计算机图像分析系统 (Le ica)测量血管横切面上血栓面积。1 .3 大鼠血浆凝块回缩实验<7>另取♂SD大鼠 2 0只 ,从大鼠颈总动脉放血 ,与3.8%柠檬酸钠以 9∶1体积混合抗凝。相对离心力40 0×g离心 1 0min制取富血小板血浆 ,再以相对离心力 2 80 0×g离心 1 0min制取贫血小板血浆 ,用贫血小板血浆将富血小板血浆的血小板数调整为2 0 0× 1 0 9L-1 备用。每管取备用富血小板血浆 0 .6mL ,置于未硅化的玻璃试管中 ,对照组加入 0 .0 5mLPBS ;APLA2 Ⅰ 5个剂量组分别加入终浓度为 0 .1 ,0 .5 ,2 .0 ,4.0和 8.0mg·L-1 的APLA2 Ⅰ。 37℃温浴1 0min ,再加入 0 .1mL牛凝血酶 50kU·L-1 ,继续温浴 2h后 ,轻轻挑出血浆凝块 ,测量析出的血清量。血浆凝块回缩率 =析出的血清量÷总体积× 1 0 0 %。每只大鼠可取到 2～ 4个血浆样本 ;每组内 1 0个样本分别来源于 1 0只不同的大鼠。1 .4 小鼠尾动脉出血时间实验取NIH♂小鼠 50只 ,随机平均分成 5组。对照组、阿司匹林组、APLA2 Ⅰ 3个剂量组 ,分别ip生理盐水 ,阿司匹林 1 0 .0mg·kg-1 ,APLA2 Ⅰ 1 .0 ,0 .5和0 .1mg·kg-1 。给药后 1h ,按文献 <8>将小鼠依次放置于鼠笼中 ,固定尾部使其垂直 ,在距尾端 1 5mm处剪断 ,将其剪断端浸入 37℃生理盐水液面下 1 5mm处 ,记录出血时间。另取 1 0只小鼠 ,ipAPLA2 Ⅰ0 .5mg·kg-1 ,4d后测定尾动脉出血时间。1 .5 纤维蛋白原水解酶活性测定参照Moran等<9> 剩余可凝纤维蛋白原法测定 ,取 1 .0g·L-1 的纤维蛋白原溶液 1 .6mL ,加入 0 .1mLAPLA2 Ⅰ (2 .0 ,1 .0g·L-1 ) ,或加入PBS 0 .1mL(对照组 ) ,混合后测A2 80nm 值 ;置 37℃水浴温育 1h后 ,加入 50kU·L-1 的牛凝血酶 0 .1mL ,继续保温育1 0min后 ,相对离心力 2 80 0×g离心 1 0min,测上清液A2 80nm值。可凝纤维蛋白原百分含量为 :(A2 80nm原液 -A2 80nm上清 ) /A2 80nm原液× 1 0 0 %1 .6 统计学处理数据均以 x±s表示 ,采用SPSS统计学软件进行方差分析 (ANOVA) ,两组之间的差异用t检验。2 结果2 .1 磷脂酶A2 Ⅰ对FeCl3 诱导的血栓形成的影响假手术组的腹主动脉压从实验开始至结束无明显变化 ,说明仅手术操作而不敷FeCl3 滤纸不会引起腹主动脉压变化。模型组腹主动脉环抱FeCl3 滤纸后 ,经 (31± 4)min即血栓形成时间 ,远端腹主动脉压因血栓形成而降至最低腹主动脉压为 (4.0±0 .5)kPa,之后则稳定于此。与模型组比较 ,预iv阿司匹林和APLA2 Ⅰ均可抑制FeCl3 诱导大鼠腹主动脉血栓形成后的腹主动脉压下降 ,使远端腹主动脉下降减缓即血栓形成时间延长 ,并使下降幅度减少 ,即最低腹主动脉压增高 (表 1 )Tab 1 . EffectofacidicphospholipaseA2 Ⅰ (APLA2 Ⅰ )onratabdominalaorticthrombosisinducedbyFeCl3Group Dose/mg·kg- 1Thrombosistime/minInitialAAP/kPaLowestAAP/kPaSham 0 nothrombosis 17.0± 0 .8 16.2± 0 .8 Model 0 3 1± 416.7± 0 .64.0± 0 .5Aspirin pretreated 10 .0 62± 7 16.7± 0 .58.1± 1.1 APLA2 Ⅰ pretreated 1.0 60± 7 15.4± 0 .7 7.7± 1.0 0 .553± 5 16.2± 0 .46.8± 0 .8 0 .14 9± 6 15.9± 0 .55.4± 0 .7 TheratswerepretreatedivwithPBS (shamandmodelgroup) ,aspirinandAPLA2 Ⅰfor 3 0min .Then ,afilterpaper (1.0cm× 0 .5cm)soakedin 40 %FeCl3 wasappliedaroundthesurfaceofratabdominalaortabetweenleftandrightkidneyartery (exceptshamgroupwithPBSfilterpaper) ,thenthedistalabdominalaorticpressure (AAP)wascontinuallyrecordedbyPcLab .ThrombosistimewasthetimeintervalfromtheinitialAAPappliedwithFeCl3tothelowestAAP . x±s ,n =10 . P <0 .0 1,comparedwithmodel.2 .2 磷脂酶A2 Ⅰ对动脉血栓重量和面积及形态的影响与模型组比较 ,大鼠预iv阿司匹林 1 0 .0mg·kg-1 及APLA2 Ⅰ 1 .0 ,0 .5和 0 .1mg·kg-1 后 ,可明显抑制
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