温通活血方是临床治疗寒凝血瘀型冠心病心绞痛的有效经验方,动物实验证明该方能显著对抗实验性 心肌缺血所致的心肌损害,明显增加冠脉血流量。本文拟以体外培养的乳鼠心肌细胞为受试对象, 利用血清药理学方法进一步探讨该方对缺氧心肌的保护作用,现将实验方法及结果报告如下。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 药物 温通活血方:由延胡索、黄芪、丹参、桂枝等7味药物组成,经水煎醇沉后制成稠浸膏,每毫升稠浸膏为1.39g,每克稠浸膏含生药5 .5 5g ,1mL稠浸膏相当于生药7.73g ,实验前用蒸馏水配成相应的浓度备用;恬尔心片(盐酸地尔硫卓) :30mg 片,批号:0 10 80 3,上海延安万象药业股份有限公司生产,实验前用蒸馏水配成相应浓度备用;血府逐瘀胶囊:0 .4g 粒,批准号:ZZ—2 914 (1992 ) 0 74 8号,生产批号:0 2 0 82 0 ,天津第五中药厂生产,临用前用蒸馏水配制成相应浓度。1.1.2 仪器及试剂 二氧化碳培养箱(美国SHELDOHM2 30 0 ) ,酶标仪(芬兰LABSYSTEMS集团MK3) ,培养基RPMI16 40 (GIBCO) ,胎牛血清(天津TBD) ,胰蛋白酶、MTT(AMRESCO公司)。1.1.3 动物 SD乳鼠,出生0～72h ;SD大鼠,180～2 0 0g ,共4 0只;以上大鼠均雌雄不拘,由湖南中医学院实验动物中心提供。合格证号:医动字第2 0 —0 0 2号。1.2 方法1.2 .1 含药血清的制备 将4 0只大鼠随机分为4组,分别灌胃温通活血方3.5g (kg·d) ,恬尔心5mg (kg·d) ,血府逐瘀胶囊0 .4 8g (kg·d) ,等体积生理盐水,每天灌胃1次,连续3d ;末次给药前12h ,禁食、不禁水,给药1h后,无菌条件下颈动脉插管采血,分离血清,同组大鼠血清混合,经5 6℃、30min灭活处理后,用0 .2μm的微孔滤膜过滤除菌,置- 2 0℃冻存备用。分别为温通活血方含药血清、恬尔心含药血清、血府逐瘀胶囊含药血清和无药对照血清。1.2 .2 心肌细胞缺氧模型的建立<1,2 > 从乳鼠心室肌获取原代心肌细胞。将培养的心肌细胞以5×10 5 mL接种于2 4孔细胞培养板,在含2 0 %胎牛血清的RP MI16 40培养液中培养2 4h ,换无血清的RPMI16 40培基连续培养2 4h ,吸出培养液,并用PBS洗2次,加入预先配好的含药血清PBS(先用氮气饱和15min)。缺氧组只加氮气饱和的PBS培养,每孔1mL ,立即置于37℃、95 %N2 、5 %CO2 环境中培养30min ,再常规培养6h后吸取各孔培养液,置4℃贮存,用于心肌酶学检测。1.2 .3 心肌细胞存活率检测(MTT法) 心肌细胞以1×10 5 mL接种于96孔培养板中(10 0 μL 孔) ,共分为5组:无药血清组、缺氧组、温通活血方组、血府逐瘀胶囊组、恬尔心组,每组8孔。在含2 0 %胎牛血清RPM16 40培养液中培养,2 4h换液后分别加入不同浓度含药血清的培养液,缺氧处理同上;2h后换用无血清的RPMI16 40 (90 μL 孔) ,同时每孔加入MTT溶液(5mg mL) 10 μL ,使其终浓度为0 .5mg mL ,置37℃连续培养4h后,每孔加入DMSO(二甲亚砜)溶解液,37℃孵育30min ,在酶标仪上以4 92nm波长检测每孔OD值。1.2 .4 心肌细胞酶的检测 天门冬氨酸氨基转移酶(AST)采用酶法,乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)采用速率法,均在岛津72 0 0型全自动生化分析仪上测定。1.2 .5 细胞形态学观察 缺氧处理后6h后,在倒置显微镜下观察各组心肌细胞形态学变化并摄相。1.2 .6 统计学方法 计量资料用均数±标准差(x±s)表示,在SPSS10 .0统计软件上以方差分析和成组t检验进行统计分析。2 结果2 .1 对缺氧心肌细胞存活率的影响温通活血方、恬尔心片及血府逐瘀胶囊各浓度含药血清均能使其OD值显著提高,与缺氧组比较差异显著(P <0 .0 1) ,但相同血清浓度的3个药物组之间差异无显著性(P >0 .0 5 )。在同种药物比较中,80 %浓度与2 0 %浓度比较有显著性差异(P <0 .0 1) ,见表1。2 .2 对缺氧心肌细胞酶释放的影响温通活血方含药血清(4 0 % )、恬尔心含药血清(4 0 % )、血府逐瘀胶囊(4 0 % )均能降低缺氧模型心肌细胞培养液中LDH、AST的含量,与模型组比较差异显著(P <0 .0 1) ,但3个药之间差异无显著性(P >0 .0 5 ) ,见表2。2 .3 对培养心肌细胞形态的影响原代培养的心肌细胞单层或成簇生长,细胞与细表1 对缺氧模型心肌细胞存活率影响的比较 (x±s)组 别n 血清浓度( 10 0 μL 孔) OD值缺氧组80 0 .0 7±0 .0 12 0 0 .11±0 .0 2 无药血清组840 0 .10±0 .0 2 80 0 .0 9±0 .0 1 2 0 0 .47±0 .18 温通活血组840 0 .60±0 .15 80 1.83±0 .62 △△2 0 0 .3 6±0 .2 5 血府逐瘀组840 0 .5 9±0 .3 4 80 1.64±0 .46 △△2 0 0 .5 1±0 .2 3 恬尔心组840 0 .79±0 .2 9 80 1.79±0 .5 6 △△ 注:与缺氧组比较 P <0 .0 1,与同种药物的2 0 μL组比较△△P <0 .0 1。表2 对缺氧模型心肌细胞LDH、CK、AST释放的影响(x±s,n =6)组 别LDH(u L)CK(u L)AST(u L)缺氧组40 3 .17±74.10 1.85±0 .9810 9.93±2 4.63无药血清组3 3 9.0 0±15 0 .492 .3 7±1.7684.78±44 .3 4 正常对照组69.17±2 .99 4.87±1.1712 .5 5±2 .63 温通活血组68.67±1.5 1 4.47±0 .7914 .2 0±2 .5 6 恬尔心组68.3 3±3 .78 4.81±0 .73 13 .65±2 .76 血府逐瘀组64 .5 0±8.62 5 .0 2±1.763 1.68±46.97 注:与缺氧组比较 P <0 .0 1胞之间结合紧密;缺氧培养6h后,大部分细胞脱落、死亡,镜下所见贴壁生长细胞较少;恬尔心 组心肌细胞缺氧6h后细胞收缩,部分细胞死亡、脱落;血府逐瘀组和温通活血方组心肌细胞缺氧 6h后细胞形态基本正常,大部分细胞正常贴壁生长,见图1。表明温通活血方可显著提高心肌细胞耐缺氧损伤的能力。①正常培养的乳鼠心肌细胞(×100 ) ; ②模型组心肌细胞(×40 0 ) ; ③恬尔心组心肌细胞(×2 5 0 ) ; ④血府逐瘀组心肌细胞(×2 5 0 ) ; ⑤温通活血组心肌细胞(×2 5 0 )。图1 各组心肌细胞形态3 讨论冠心病心绞痛属中医“胸痹”、“真心痛”、“厥心痛”范畴 。“真心痛”最早见于《黄帝内经》,《灵枢·厥论》篇指出:“真心痛,手足青至节心痛甚,旦 发夕死,夕发旦死”,后世医家多把真心痛归属为“胸痹”范畴,如《金匮要略·胸痹心痛短气篇 》篇说:“胸痹不得卧,心痛彻背者,瓜蒌薤白半夏汤主之。”,《圣济总录》详尽论述了本病的 成因及其临床表现和鉴别:“心痛诸候,均由邪气客于手心主之脉,盖手少阴心之经,五脏六腑君 主之官也,……是以诸邪在心,多在包络者,心主之脉也。其候不一,有寒气卒客于藏腑,发卒痛 者;有阳虚阴厥,痛引喉者;有心背相引,善瘛伛偻者;有腹胀归于心而痛甚者;有急痛如针锥所 刺者;有其色苍苍,终日不得太息者;有卧则从心间痛,动作愈甚才;有发作种聚,往来上下,痛 有休止者。或因于饮食或从于外风,中藏既虚,邪气客之,痞而不散,宜通而塞,故为痛也。”。 真心痛的病因,明代之前有因于寒,因于气、血、痰、水之论,而明代虞传《医学正传》又指出该 病与“污血冲心”有关。现代多认为本病多由情志内伤、饮食失节,劳逸失度、冷暖失调、年老体 衰等引起,本病的病理机制为本虚标实,多为寒凝血瘀、心脉痹阻。故本方由延胡索、桂枝等组成 ,共奏芳香温通、活血止痛之功效,对寒凝血瘀型冠心病心绞痛具有良好的效果。本实验结果已经 初步证实,温通活血方含药血清对缺氧所致的心肌细胞损伤有较好的拮抗作用,除能维持受损细胞 的正常形态结构外,尚可防止心肌细胞酶的外漏,促进细胞代谢、提高其存活率,表明温通活血方 提高心肌细胞抗缺氧损伤的能力可能是该方治疗冠心病心绞痛的重要机制。在抗心肌细胞缺氧损伤 方面,该药的作用与血府逐瘀胶囊基本一致。进一步建立寒凝血瘀证动物模型来验证该方的治疗效 果,可望将其开发为治疗寒凝血瘀型冠心病心绞痛的中药新药提供重要的科学依据。温通活血方对大鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用@朱惠斌$湖南中医学院第一附属医院!湖南长沙410007
@闻晓东$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007
@梅志刚$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007温通活血方;;心肌细胞;;缺 氧损伤;;大鼠;;延胡索;;桂枝目的探讨温通活血方对大鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用。方法培养的乳鼠心肌细胞经温通活血方、恬尔心、血府逐瘀胶囊含药血清及无药物血清处理后,进行缺氧再给氧处理 ,分别观察心肌细胞存活率 (MTT)、心肌酶及心肌细胞形态变化。结果温通活血方、恬尔心片及血府逐瘀胶囊含药血清均能显著提高缺氧心肌细胞存活率 ,显著降低缺氧
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