单纯疱疹病毒胸苷激酶 (herpessimplexvirusthymidinekinase ,HSV tk)基因是肿瘤基因治疗中研究较为深入的“自杀基因”之一。关于HSV tk基因联合更昔洛韦 (ganciclovir,GCV)系统的研究较多 ,HSV tk基因可将GCV磷酸化为一磷酸GCV ,继而在哺乳动物TK酶的催化下最终转变为三磷酸GCV ,从而抑制DNA聚合酶的活性 ,阻止DNA合成 ,导致细胞死亡<1> 。而拓扑替康 (topotecan ,TPT)是临床治疗卵巢癌常用的化疗药物 ,疗效已得到公认 ,但它同时也带来了各种不良反应 ,并且肿瘤细胞对其可以产生耐药。作者观察了人端粒酶逆转录酶 (humantelomerasereversetranscriptase ,hTERT)基因启动子调控的HSV tk/GCV系统对卵巢癌SKOV3细胞的体外疗效 ,并将其与TPT联合应用 ,探讨它们的相互作用 ,并为其最终应用于临床提供实验依据。1 材料与方法1 .1 材料 GCV购自湖北科益药业股份有限公司 ;DMEM培养液、胎牛血清购自Hyclone公司 ;TPT(商品名金喜素 )由贵州汉方制药有限公司提供。大肠杆菌JM1 0 9、PUC1 8 hTERT载体和pcDNA3.1 (+) TK载体由本室保存<2 ,3> 。逆转录病毒载体构建所需材料同文献 <4 >。1 .2 SKOV3细胞转染及筛选 hTERT调控的HSV tk基因逆转录病毒载体的构建、SKOV3细胞转染及抗性克隆细胞 (SKOV3/tk)的筛选 ,参见文献 <4 >。1 .3 SKOV3/tk细胞对GCV的敏感性测定 将SKOV3/tk细胞接种于 96孔培养板 ,每孔含 5 0 0 0个细胞 ,以 1 0 0 μl培养液培养 ,共滴板 5块。将每板细胞分为 5组 ,每组 6孔 ,2 4h后每组分别给予不同质量浓度的GCV (0 .1mg/L ,1mg/L ,1 0mg/L ,1 0 0mg/L ,1 0 0 0mg/L) ,并设只含培养液对照孔。以MTT法 ,每d测定各组细胞密度的变化。MTT法操作过程如下 :孵育规定时间前 4h取出培养板 ,每孔中加入 1 0g·L- 1的MTT 2 0 μl ,继续培养 4h后取出 ,弃去培养液 ,每孔加入 2 0 0 μl二甲基亚砜振荡 1 0min ,混匀后 ,在 96孔酶标仪上测定 4 92nm的吸光度 (A(4 92nm) )。细胞存活率 =A(实验值 ) /A(对照值 )× 1 0 0 %。1 .4 SKOV3/tk细胞对TPT的敏感性测定 除每组分别给予不同浓度的TPT(1mg/L ,1 0mg/L ,1 0 0mg/L ,1 0 0 0mg/L)外 ,其他操作同 1 .3。1 .5 GCV和TPT联合应用对SKOV3/tk细胞生长的影响 除每组分别给予不同浓度的TPT(5 μg/L ,1 0 μg/L)和 1 0 0mg/L的GCV外 ,其他操作同 1 .3。1 .6 统计学处理 所有数据均用 x±s表示。 2组间的比较用t检验 ,多组间比较用方差分析和q检验。2 结果2 .1 GCV对SKOV3/tk细胞生长的影响 见表 1。2 .2 TPT对SKOV3/tk细胞生长的影响 见表 1。表 1 GCV、TPT及 2者联用对SKOV3/tk细胞生长的影响组别SKOV3/tk细胞存活率 / %对照组 1 0 0GCV 0 .1mg/L 1 0 6 .4 0± 3.5 6 1 .0mg/L 1 0 7.30± 3.4 5 1 0 .0mg/L 89.2 0± 2 .89a 1 0 0 .0mg/L 71 .6 0± 2 .6 7a 1 0 0 0 .0mg/L 1 5 .6 0± 1 .78aTPT 1 .0 μg/L 1 1 2 .80± 4 .32 a 1 0 .0 μg/L 4 8.6 0± 2 .86 a 1 0 0 .0 μg/L 2 2 .0 0± 2 .2 4 a 1 0 0 0 .0 μg/L 1 5 .6 0± 1 .0 2 aGCV(1 0 0mg/L) +TPT 5 .0 μg/L 35 .5 0± 2 .1 2 ab 1 0 .0 μg/L 2 7.6 0± 1 .4 8aa:与对照组比较 ,P <0 .0 5 ,b :与GCV (1 0 0 .0mg/L) +TPT(1 0 .0 μg/L)组比较 ,P <0 .0 52 .3 GCV与TPT联合应用对SKOV3/tk细胞生长的影响 见表 1。3 讨论 HSV tk/GCV系统在对各种恶性肿瘤的体内体外治疗实验研究中 ,显示出良好的治疗效果。在目前基因治疗尚未完全成熟地应用于临床之前 ,将基因治疗与传统的治疗方法相结合 ,发挥相互之间的协同作用也是目前基因治疗的一个方向。本研究结果显示 ,体外转导了HSV tk基因的SKOV3卵巢癌细胞 ,对GCV的敏感性较野生型细胞明显增加 ,GCV对SKOV3/tk细胞的最低有效浓度为1 0mg·L- 1;TPT为 1 0 μg·L- 1;而 1 0 0mg·L- 1GCV与TPT联用时 ,TPT最低有效浓度为 5 μg·L- 1。说明HSV tk/GCV系统合用低浓度的TPT对细胞的抑制作用强于任一药物单独应用。其具体原因可能与 2种药物不同的作用机制有关。GCV主要通过其磷酸化产物抑制DNA聚合酶的活性来杀伤肿瘤细胞 ;而TPT则主要通过干扰DNA拓扑异构酶的功能 ,破坏DNA的结构 ,从而抑制DNA的合成。HSV tk基因作为外源性基因 ,在导入宿主细胞后 ,其表达的稳定性对整个系统的疗效起着重要的作用 ,而HSV tk基因的丢失、甲基化及重组等都会影响其作用的发挥<5> 。作者发现转染有HSV tk基因的卵巢癌细胞对GCV的敏感性不如其他研究者报告的高<6 > ,除了靶细胞的差异外 ,可能还和外源基因在细胞内所受到的这些影响有关。另外可能和采用的启动子有关。为了增加基因表达的特异性 ,不少学者采用了组织特异性调控元件如AFP增强子<7> 、PSA<8> 和hTERT<9> 启动子等。通常采用的hTERT启动子是包括了核心启动子的不同序列长度 ,有的甚至包括了一两个外显子 ,因为认为该外显子对启动子活性有调控作用。由于采用不同的启动子序列长度 ,而不同序列长度的启动子活性在不同的细胞内或者细胞的不同时期可能会受到差异调控 ,因此外源基因的表达也可能会受到不同程度的影响。作者采用了特异克隆的ATG上游hTERT启动子 ,它能够在卵巢癌细胞中有效表达 ,为肿瘤的靶向基因治疗提供了实验依据。综上所述 ,根据本研究结果 ,TPT、GCV联合HSV tk自杀基因治疗卵巢癌 ,效果较好 ,而且由于化疗药物用量的减少可能减轻不良反应 ,因而将会有较好的临床应用前景拓扑替康和更昔洛韦单独或联合应用对SKOV3/tk细胞生长的影响@郭玉忠$郑州大学细胞生物学研究室!郑州450052
@史惠蓉$郑州大学第一附属医院妇产科!郑州450052
@姜国忠$郑州大学细胞生物学研究室!郑州450052
@李克虹$郑州大学第一附属医院妇产科!郑州450052
@王建民$郑州大学细胞生物学研究室!郑州450052
@薛乐勋$郑州大学细胞生物学研究室!郑州450052hTERT启动子;;HSV-tk基因 ;;卵巢癌细胞;;拓扑替康;;更昔洛韦目的:探讨更昔洛韦(GCV)与拓扑替康(TPT)单独或联合应用对携带有hTERT启动子调控的HSVtk基因的SKOV3细胞生长的影响。方法:将hTERT启动子调控的HSV tk基因重组逆转录病毒载体成功转染人卵巢癌SKOV3细胞(SKOV3/tk细胞) ,用MTT法观察SKOV3/tk细胞对GCV、TPT的敏感性;观察合用GCV和TPT对S KOV3/tk细胞的杀伤作用。结果GCV及TPT对SKOV3/tk细胞的最低有效浓度分别为10mg/L和1 0 μg/L ,1 0 0mg/LGCV与TPT合用时TPT对SKOV3/tk细胞的最低有效浓度为5 μg/L。结论:GCV合用TPT较TPT单用更能抑制携带有HSV tk基因的SKOV3细胞的增殖1 MesnilM ,YamasakiH .Bystandereffectinherpessimplexvirus thymidinekinase/ganciclovircancergenetherapy:roleofgap junctionalintercellularcommunication.CancerRes,2000,60(15):3989
2 郭玉忠,李杰,姜国忠,等.人端粒酶逆转录酶基因启动子的克隆及其真核表达载体的构建.郑州大学学报(医学版),2004,39(1):44
3 李杰,郭玉忠,谢华,等.单纯疱疹病毒胸苷激酶基因真核表达载体的构建及其在食管癌细胞中的表达.郑州大学学报(医学版),2004,39(1):47
4 郭玉忠,姜国忠,李克虹,等.hTERT启动子调控的HSV tk基因逆转录病毒载体的构建及SKOV3转染细胞的生物学特性观察.郑州大学学报(医学版),2004,39(4):566
5 XuL ,YeeJK ,WolffJA ,etal.Factorsaffectinglong termsta bilityofMoloneymurineleukemiavirus basedvectors.Virolo gy,1989,171(2):331
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