根瘤菌与豆科作物的共生固氮作用在改良土壤肥力、提高作物产量、改善生态环境等方面有着十分重 要的意义和作用。在农业和林业生产中,接种根瘤菌以提高豆科作物固氮能力是一种常见的农业措 施。豆科作物-根瘤菌共生体的共生固氮效率是由根瘤菌和豆科作物双方的基因所控制,涉及到宿 主植物、根瘤菌和环境间复杂的互作,豆科作物和根瘤菌间完全有效的结合仰赖宿主植物相关基因和根瘤菌相关基因的相容性<1>。因此,为每一种豆科作物筛选最有效的根瘤菌是必须的。由于释放到田间的根瘤菌必然要与土著 根瘤菌在土壤营养、生活空间及宿主植物等方面进行竞争,其竞争能力的大小直接影响到能否提高 作物的产量和品质。为了深入的了解筛选的根瘤菌在豆科作物上的结瘤状况,需要一个可靠、快速 的检测手段。目前用来检测根瘤菌的方法有免疫学方法、酶标记和DNA分子标记。免疫学方法有荧光抗体法(FA)、酶联免疫反应(ELISA)血凝结法等,由于有些交叉反应不起作用,因此有相当的局限性<2 > ;常用的酶标记主要是同工酶标记,但由于同工酶是基因的产物,仅为DNA全部多态性为基础的遗传标记,而且其特异性易受环境条件等因素的影响<3> ;DNA分子标记是以DNA多态性为基础的遗传标记,能稳定遗传,且遗传方式简单。当前DNA 多态性的各种分子标记技术发展迅速,已有数十种,并在动植物遗传中广泛的应用。随机扩增多态 性DNA(简称RAPD)是用短的随机序列DNA作为引物对基因组DNA进行PCR扩增而产 生的多态性DNA片段,在研究植物病原菌上应用广泛,但应用RAPD分子标记技术研究筛选根瘤菌在宿主植物上的结瘤状况尚属首次报道。1 材料与方法1.1 菌株及来源试验用CCBAU30 1 38菌株,来源于河北省,是在温室条件下,针对河北省吴桥土壤和Vector苜蓿品种筛选的高效菌株,该菌株在所有供选择的1 9株菌株中,效果最好。1 .2 培养条件及培养基将30 1 38接种于含YMA培养基平板上,在2 8℃培养4 8h。1 .3 试剂Taq酶由鼎国公司提供,d NTPs为Ta Ka Ra产品,PCR引物由上海生工合成;生化与分子生物学试剂购自原平皓试剂公司、上海生工生物公司、鼎国生物公司。1 .4 CCBAU30 1 38菌株总DNA提取取单菌落接种于5 m L 相应的YMA培养基中,在2 8℃、1 5 0 r/min培养3d。取1 .0 ml菌液于1 .5 ml离心管中,1 30 0 0r/m in离心2 min,弃上清。用SDS-蛋白酶K裂解,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖,再用异丙醇沉淀来提取总DNA<4 > 。DNA沉淀溶于1 0 0μl×TE缓冲液,- 2 0℃保存备用。1 .5 土著菌数量的测定从田间小区中随机挑选5个点,将每一点地表2～3cm的植物残茬及土壤去掉,取30 cm以内的土壤,风干后充分混匀,利用MPN (m ostprobable number)法计算土壤中的土著根瘤菌<5> 数。1 .6 田间接种2 0 0 2年4月2 8日将培养好的根瘤菌剂通过测定OD值计数后,在田间通过自来水按照一定的比例稀释,在保证每一粒种子接菌数达到1 0 7个情况下,均匀的适于田间的播种沟中,播后立即覆土。1 .7 根瘤采集及处理在播种后1 4 0 d,于2 0 0 2年9月1 8日在田间接种小区随机进行根瘤采集。在田间挖取后进行冲洗。将冲洗干净的根瘤放在培养皿中,先用95 %乙醇处理2 0 s,用超纯水冲洗5～6次后,用5 %次氯酸钠处理3min,再用超纯水冲洗5～6次。贮存于- 2 0℃冰箱中备用。1 .8 根瘤类菌体DNA的提取将冰箱中取出采集的根瘤分别置于1 .5 ml Eppendorf管中,按照陈强等<6 >方法提取类菌体DNA。以已知浓度的λDNA作为标准,1 %琼脂糖凝胶电泳确定待测DNA浓度后,- 2 0℃保存DNA。1 .9 PCR模板的制备及引物合成从冰箱取出贮备的根瘤,待到完全融解后,随机挑取单一根瘤放在1 .5 ml、装有30 μl超纯水的Eppendorf管中,用灭菌牙签充分破碎根瘤。先放在液氮中处理2 m in,再在6 5℃水浴中处理2 min,重复处理3～5次。将上述处理过的样品放在离心机中,1 2 0 0 0 r/min,离心1 0 m in,吸取上清液作为PCR反应体系的模板。菌体PCR模板的制备是从单菌落的培养物中随机挑取一小部分菌体于1 .5 ml、装有30μl超纯水的Eppendorf管中,处理方式与根瘤处理相同。1 .1 0 CCBAU30 1 38田间根瘤的PCR检测采用Idaho Technology毛细管PCR仪扩增,根据Diane.M.Hebb筛选出比较适合区分苜蓿根瘤菌随机引物,由上海生工完成了1 0个碱基寡聚核苷酸的生物合成,设计如下:(1 )随机引物 5′- AGTCGTCCCC- 3′。(2 ) 1 0 μl反应体系中 随机引物0 .3μl(5 0 pmol/L,约35 ng) ,d NTP1 μl(2 .5 mmol/L) ,1 0×buffer1 μl,BSA1 μl(2 .5 μg/μl) ,模板DNA1 μl() ,Taq DNA聚合酶0 .8μl(2 U/μl) ,dd H2 O4 .9μl。混匀后吸入毛细管中,加热封口。PCR反应程序为94℃预变性DNA 1 5 s后,进行5个循环,每个循环为92℃变性5 s,4 0℃退火1 0 s,然后72℃延伸6 0 s;接下来进行35个循环反应每个循环为92℃变性2 s,4 5℃退火5 s,72℃延伸6 0 s;最后92℃变性2 s,4 5℃退火2 s,72℃延伸2 m in;将获得的PCR产物4℃下保存。M:Marker( λDNA/ H ind ) ;1:960 68根瘤nodules of960 68;2 :960 68菌体strain of960 68;3 :960 77菌体strain of960 77;4:3 0 13 8菌体strain of3 0 13 8;5 :N2 10菌体strain of N2 10 ;6:960 68瘤子DNA DNA extra cted from 960 68nodules;7:960 77菌体总DNATotal DNA extracted from 960 77strain;8:960 77菌体DNA DNAextracted from 960 77strain图1 利用Rhizobium meliloti菌体、根瘤,以及菌体和根瘤提取的DNA为模板的PCR扩增结果Fig. 1 RAPD-PCR amplification of Rhizobium meliloti DNAobtained from nodules,strains,and the DNA extracted from thestrains and nodules1 .1 1 将扩增的产物直接进行1 .0 %琼脂糖凝胶电泳(1 6孔板在80 V电压,9孔板5 0 V电压) 1 h,EB染色,U V下检查,照相。2 结果与分析2 .1 利用PCR扩增技术区分菌体、菌体DNA、根瘤及根瘤DNA图1中是分别利用Rhizobium meliloti菌体和直接从苜蓿根部采摘的根瘤,采用液氮冻融法破碎菌体或根瘤,离心后获得的含Rhizobium meliloti DNA的上清液为模板的PCR扩增结果,图中2、3、6分别是96 0 6 8的根瘤、菌体提取的DNA为模板的PCR扩增结果,从中可以看出,它们PCR产物的带型一致 ,说明冻融法处理获得的上清液可以直接作为PCR模板,进行扩增。从图中还可以看出,CCBAU960 6 8、CCBAU 30 1 38、CCBAU 96 0 77及CCBAUN2 1 0扩增结果不同,说明利用PCR扩增技术可以直接区分不同的菌系。2 .2 田间对照区根瘤PCR电泳检测结果随机挑取从田间对照区采集的根瘤,利用液氮冻溶法进行处理,离心后获得的含Rhizobium meliloti DNA的上清液作为模板进行PCR扩增,扩增后得到电泳图谱(图2 )。从电泳结果可以看出,对照区土著菌可分为3种类型,其中2、3、7、9、1 0、1 2为第1种类型,4、5、6、1 1为第2种类型,8为第3种类型。其中第1种、第2种所占的比例较多,第3种所占比例较少。而且土著菌的带型与检测菌的带型明显不同。2 .3 紫花苜蓿接种根瘤菌的田间占瘤率图3中第1条泳带为CCBAU30 1 38菌体DNA的PCR扩增结果,2～1 4为随机采集的田间根瘤,利用冻溶法处理,离心后图2 对照区根瘤RAPD-PCR电泳结果Fig. 2 RAPD-PCR amplification of Rhizobium meliloti DNAobtained from nodules isolated from uninoculated control plots获得的含Rhizobium meliloti DNA的上清液作为模板进行PCR扩增,从扩增结果可以看出,与第1条泳带完全相同的泳道分别是6、8、1 0、1 2、1 3和1 4共计6条泳道,占瘤率为4 6 .2 %。图4中与DNA电泳条带(1 4 )相同的泳带为分别为3、4、5、7、8、9和1 0共计7个,因此占瘤率为5 3.9%。图5中1 4个泳道全部为田间根瘤处理后PCR扩增的结果,由图中可以看出与与菌体DNA条带完全相同的泳道有1、4～6、8和1 0 ,共计6个,占瘤率为4 2 .9%。上述结果可以看出,接种1 4 0 d后,该接种菌的占瘤率为4 7.7% ,即接种根
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