自由基是带有未成对电子的分子或离子。由于具有很高的反应活性,它们一旦产生将很快与周围 分子发生反应,由此导致各种破坏作用。自由基氧化及其中间产物严重伤害生物膜、酶、维生素、 蛋白质及活细胞功能,其中一些还是公认的致癌物<1>,现已明确许多疾病,如:肿瘤、炎症、 心脑缺血、动脉粥样硬化等等,都与自由基有关;而自由基在食品和化工产品氧化中的作用更是众 所周知,因此有关抗氧化剂清除自由基的研究得到普遍关注,然而合成抗氧化剂往往有毒副作用。 为了减轻自由基的危害,目前寻找高效、价廉、低毒甚至无毒的抗氧化剂的工作倍受关注<2～6 >。在天然、营养、回归大自然的热潮中,人们越来越趋向于使用天然抗氧化剂。因此,寻找天然 的抗氧化剂,特别是在我们中华民族的中草药宝库中,筛选出具有抗自由基损伤,保护DNA的物 质,具有极其重要的意义。茶多酚和银杏提取物对自由基有一定的清除作用,但是它们的清除能力的综合比较研究未见报道。本文主要研究上述2种天然抗氧化剂对自由基清除能力的比较。1 材料与仪器11 实验材料实验材料为茶多酚(纯度99%,批号:991227,茶多酚总量采用没食子酸乙酯标准曲线法测定,其中,EGCG的含量为75 2%。浙江大学农业与生物技术学院杨贤强教授馈赠)、银杏提取物(纯度97%,其中黄酮含24 0%内酯含6 0%,宁波市中药制药厂;批号:20000041);小牛胸腺DNA、次黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶和鲁米诺均为Sig ma公司产品,其它试剂均为分析纯。1 2 仪 器BPCL-G-2微弱发光测量仪及BPCLApp2 6数据处理工作站(中国科学院北京生物物理研究所),工作电压890V,温度为25±0 5℃,pHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂),涡旋混合器(上海环宇仪器厂),离心沉淀机(上海医用分析仪器厂),自动超纯水蒸馏器1810B(上海玻璃仪器一厂)。2 实验方法21 抗氧化剂清除OH-的测定方法采用CuSO4-VC-H2O2-酵母悬浮液体系化学发光检 测法<5>,仪器预备:BPCL-Ⅱ超微弱发光仪每次使用前预热约30min,启动BPCL 测量程序,C-14标准光源校正,调节“Hv-VAdj”旋钮直到计数维持在5000±10 0左右,然后测量噪声本底值,计数一般应在100以下,此时,仪器准备完毕。以下实验仪器预备同。向测量管中加入18mmol/L的VC0 2mL,1 8mmol/LCuSO40 4mL,75mg/mL的酵母0 2mL(加入时摇匀),含某一抗氧化剂一定质量浓度(分别为0、0 5mg/mL、1mg/mL、1 5mg/mL、2mg/mL)的pH6 2的0 05mol/L磷酸钠缓冲液(PBS)0 6mL,置入化学发光仪的测量室,再注入33 3mmol/L的H2O20 6mL,启动测量程序,取15s～60s积分的发光强度(6s一个积分段,)用于计算,3次平行样品重复。比较样品的清除OH-的活性能力。2 2 抗氧化剂清除O-2的测定方法采用次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-鲁米诺体系化学发光检测法<5>,在测量管中加入1mL反应混合液,其含0 1mL的鲁米诺原液,0 1mL次黄嘌呤原液,0 6mLTris-HCL,0 2mL黄嘌呤氧化酶工作液,(恒温30℃),置入化学发光仪的测量室,向反应混合液中注入0 2mL一定质量浓度(分别为0、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、1 6μg/mL)的各种抗氧化剂溶液,启动测量程序,以发光峰值为标准进行计算,3次平行样品重复。比较不同抗氧化剂样品清除O-2的活性能力清除率=X0-XnX03 结果与讨论31 清除OH-中天然抗氧化剂质量浓度用CuSO4-VC-H2O2-酵母悬浮液化学发光体系 研究清除OH-中两种天然抗氧化剂质量浓度与抑制率的关系见表1。 表1表明,在本论文实 验的质量浓度范围内(0～2mg/mL),两种抗氧化剂都具有清除OH-的能力。清除率与质量浓度之间存在较好的线性相关(RTP=09836,REGb=0 9780);两种抗氧化剂对OH-清除能力有所区别。比较相同质量浓度下清除率及半抑制率质量 浓度(ρ(IC50),ρ(IC50)就是清除率为50%时的抗氧化剂质量浓度,单位mg/mL),茶多酚的清除OH-的能力较强,其ρ(IC50)相对最小,为1049mg/ml;银杏提取物相对较弱,其ρ(IC50)相对较大,ρ(IC50)为1 433mg/mL。表1 两种抗氧化剂清除OH-质量浓度与清除率的关系Table1 Rel ationshipbetweentheconcentrationandinhibiti onrateonthescavengingofhydroxylradical抗氧化剂质 量浓度/(mg/mL)相对发光强度X±S,n=5清除率/%ρ(IC50)/(mg/mL)茶多酚质量浓度014562±112300510126±104230 51 07154±81450 91 0491 55269±65163 82 04239±34670 9银杏提取物质量浓度014189±121100 511365±90820 01 08259±104741 81 4251 56678±37152 92 04987±55664 93 2 清除O-2中天然抗氧化剂质量浓度用次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-鲁米诺化学发光体系研究清除 O-2两种抗氧化剂质量浓度与清除率的关系见表2。表2 两种抗氧化剂清除O-2质量浓度与 清除率的关系Table2 Relationbetweenconcentrationan dinhibitionrateofscavengingsuperoxideaninor adical抗氧化剂质量浓度/(μg/mL)相对发光强度X±S,n=5清除率/%ρ(IC50)/(μg/mL)茶多酚质量浓度02026±65011650±8118621287±7636 53 0794760±6562 58325±3184 016210±3390 0银杏提取物质量浓度02108±103011821±10813 621487±8429 53 4254876±5658 48406±5180 716289±3486 3 表2表明,在本实验质量浓度范围内(0～16μg/mL),两种抗氧化剂都具有清除O-2的能力。对O-2清除率与抗氧化剂质量浓度之间存在较好的线性相关(RTP=0 9910,REGb=0 9996);两种抗氧化剂对O-2清除能力也有所区别。比较同等质量浓度下清除率及半抑制率质量浓度(ρ(IC50)),茶多酚的清除O-2的能力较强,其ρ(IC50)相对较小,为3079μg/mL;银杏提取物较弱,ρ(IC50)为3 425μg/mL。4 结 论上述表明,在本实验质量浓度范围内,茶多酚、银杏提取物均具有清 除OH-、O-2自由基的作用。两种抗氧化剂对OH-、O-2清除率与质量浓度之间存在较好的线性相关。两者相比较,以茶多酚清除OH-的能力最强,其ρ(IC50)为1049mg/mL;银杏提取物较弱,ρ(IC50)为1 433mg/mL;清除O-2能力也以茶多酚为最强,其ρ(IC50)为3 079μg/mL;银杏提取物较弱,为3 425μg/mL;两种抗氧化剂清除O-2的能力要大于清除OH-的能力。两种天然抗氧化剂清 除自由基作用的研究@杨广花$江苏工业学院化学工程系!江苏常州213016天然抗氧化剂; ;自由基;;化学发光利用生物化学发光法(CuSO4-VC-H2O2-酵母悬浮液体系化学 发光检测法和次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-鲁米诺体系化学发光检测法)研究了两种天然抗氧化剂( 茶多酚和银杏提取物)对自由基的清除作用。实验表明,茶多酚、银杏提取物均具有清除OH-、 O-2的能力较强,银杏提取物相对较弱。2自由基的作用。两者相比较,以茶多酚清除OH-和 O-<1>MarxJL.OxygenFreeRadicalsLinkedtoManyDiseases
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<2>ScottG.Antioxidants.BullChemSocJpn,1988,61(4):165-170
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<6>蔡志强,韩金多,李亮,等 茶多酚与DNA相互作用的初步探讨 江苏石油化工学院学报,2002,14(3):25-28颗ǘ确段?0～16μg/mL), 两种抗氧化剂都具有清除O-2的能力。对O-2清除率与抗氧化剂质量浓度之间存在较好的线性相关(RTP=09910,REGb=0 9996);两种抗氧化剂对O-2清除能力也有所区别。比较同等质量浓度下清除率及半抑制率质量浓度(ρ(IC50)),茶多酚的清除O-2的能力较强,其ρ(IC50)相对较小,为3079μg/mL;银杏提取物较弱,ρ(IC50)为3 425μg/mL。4 结 论上述表明,在本实验质量浓度范围内,茶多酚、银杏提取物均具有清 除OH-、O-2自由基的作用。两种抗氧化剂对OH-、O-2清除率与质量浓度之间存在较好的线性相关。两者相比较,以茶多酚清除OH-的能力最强,其ρ(IC50)为1049mg/mL;银杏提取物较弱,ρ(IC50
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