十字花科植物菘蓝 Isatis indigotica Fort.为常用中药材大青叶、板蓝根的主要来源 ,是我国南北各地大宗栽培的重要药用植物 ,历版中国药典均有收载。研究表明不同栽培居群的菘蓝在药材性状、理化特征、有效成分含量和药理效用等方面存在显著差异<1,2 > 。生态环境的差异以及物种遗传变异是导致药材品质差异的主要影响因素 <3 ,4 >。等位基因酶 ( allozyme,简称等位酶 ) ,是同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式 ,作为结构基因编码的产物 ,其变化能很好地代表DNA分子水平上的变化 ,表明等位基因变化的存在。等位酶的遗传和表达遵循孟德尔定律 ,酶位点的不同等位基因都是等显表达的 ,从酶谱上可以直接分析识别出编码它们的等位基因 ,且能统计出等位基因频率和基因型频率 ;作为一种稳定的基因组标志比形态特征更直接地反映了遗传信息 ,通过众多位点的抽样分析可以推断或代表整个基因组的遗传学情况。等位酶分析方法目前是了解天然居群的遗传结构、基因丰富程度以及栽培作物种质资源遗传多样性的重要手段<5> 。我们将各地不同栽培居群菘蓝移栽于上海市崇明岛同一块试验田内 ,采用水平切片淀粉凝胶电泳方法对异地栽培的不同居群菘蓝进行等位酶分析 ,考察菘蓝种内居群间的遗传结构差异 ,旨在为深入研究种质遗传资源因素对菘蓝药材优良品种形成的作用及调控机制提供依据。1 材料和方法1 .1 药材和仪器 在全国各地采集不同栽培居群的菘蓝种子 ,异地栽培于上海市崇明岛同一块试验田 ,经鉴定为 Isatisindigotica Fort.,编号见表 1。通过细胞学观察 ,确证均为二倍体植株 ,染色体数目2 n=1 4<6>。实验所用试剂均为 Sigma公司产品。“SG- ZW”型水平切片电泳仪 (北京六一仪器厂 ) ,玻璃门冰箱 (青岛海尔公司 ) ,- 80℃低温冰箱 (美国Frigor公司 )。表 1 菘蓝不同栽培居群的遗传变异指标Tab 1 Genetic variability in 13populations of Isatis indigotica Fort.Population A P H o H e1 Fuyang,Anhui 1.4( 0 .2 ) 2 6.7 0 .0 67( 0 .0 3 1) 0 .0 78( 0 .0 3 9)2 Sixian,Anhui 1.4( 0 .2 ) 13 .3 0 .0 3 0 ( 0 .0 2 0 ) 0 .0 40 ( 0 .0 2 3 )3 Bozhou,Anhui 1.2 ( 0 .1) 13 .3 0 .0 2 8( 0 .0 19) 0 .0 3 1( 0 .0 2 2 )4 Yuzhou,Henan 1.3 ( 0 .2 ) 2 6.7 0 .0 5 3 ( 0 .0 2 6) 0 .0 73 ( 0 .0 45 )5 Chifeng,Neimonggol 1.4( 0 .2 ) 2 0 .0 0 .0 47( 0 .0 2 7) 0 .0 79( 0 .0 42 )6 Taigu,Shanxi 1.1( 0 .1) 13 .3 0 .0 15 ( 0 .0 15 ) 0 .0 2 7( 0 .0 18)7 Sheyang,Jiangshu 1.2 ( 0 .1) 2 0 .0 0 .0 40 ( 0 .0 2 2 ) 0 .0 3 7( 0 .0 2 0 )8 Shengyang,L iaoning 1.3 ( 0 .2 ) 2 6.7 0 .0 3 0 ( 0 .0 14 ) 0 .0 3 5 ( 0 .0 17)9 Lingquan,Anhui 1.3 ( 0 .2 ) 13 .3 0 .0 63 ( 0 .0 3 8) 0 .0 68( 0 .0 40 )10 Anguo,Hebei 1.4( 0 .2 ) 2 6.7 0 .0 47( 0 .0 2 1) 0 .0 5 9( 0 .0 2 6)11 Xingtai,Hebei 1.3 ( 0 .2 ) 2 6.7 0 .0 3 7( 0 .0 17) 0 .0 5 6( 0 .0 2 7)12 Xianyang,Shanxi 1.5 ( 0 .2 ) 3 3 .3 0 .0 70 ( 0 .0 3 3 ) 0 .10 9( 0 .0 43 )13 Taixing,Jiangshu 1.4( 0 .2 ) 2 6.7 0 .0 70 ( 0 .0 3 9) 0 .0 5 9( 0 .0 3 1) Standard deviation in parentheses1 .2 方法 按照文献 <5>的配方配制复杂提取缓冲液 ,电泳、凝胶缓冲液。将移栽的菘蓝以居群为单位 ,各随机取样 2 0株 ,连根新鲜保存 ,取各株的新鲜幼嫩绿叶 1～ 2 cm2 ,加 3～ 5滴复杂磷酸盐缓冲液研磨均匀 ,用新华 1号滤纸剪成 2 .5cm× 6.5cm的沁子 ,蘸取提取液 ,于 - 80℃冰箱保存备用。称取水解淀粉 31 .5g,加 1 0 0 0 ml蒸馏水 ,搅匀 ,煮沸 ,抽气 ,注入模盘内 ,待冷却后 ,表面加盖玻璃板 ,室温下冷凝过夜 ,使凝胶浓度为 1 2 .5%。每次电泳前在冷冻保存的沁子上加 1滴 2 %的2 -巯基乙醇 ,使其解冻后上样。在 4℃冰箱中 ,使用“SG- ZW”型 2 50 ml水平切片电泳槽进行电泳 ,控制电流为 30～ 35m A。以溴酚蓝钠盐为凝胶前锋线标记 ,跑出 1 0～ 1 5cm,即可停止电泳 ,将凝胶切片染色。共测定了 8个酶系统 (表 2 ) ,其中 AAT和LAP酶采用液染法 ,PGD,PGI,PGM,IDH,HEX和MDH酶采用胶染法。 对酶谱进行记录时 ,若有多个位点 ,从阳极到阴表 2 检测的酶系统和电泳、凝胶缓冲系统Tab 2 Enzym e assayed and buffers system s usedEnzym e systems Abbr. E C No. Buffers systemsPhosphoglucomutase PGM EC5 .4.2 .2 Sodium borate/ Tris-Citric acid( p H8.6)Phosphoglucoisomerase PGI EC 5 .3 .1.9Sodium borate/ Tris-Citric acid ( p H 8.6)Phosphogluconate dehydrogenase PGD EC 1.1.1.44L ithium borate/ Tris-Citric acid ( p H 8.0 )Hexokinase HEX EC 2 .7.1.1Sodium borate/ Tris-Citric acid ( p H 8.6)Isocitric dehydrogenase IDH EC1.1.1.42 L ithium borate/ Tris-Citric acid( p H8.0 )Malate dehydrogenase MDH EC 1.1.1.3 7 L ithium borate/ Tris-Citric acid ( p H 8.0 )L eucine aminopeptidase L AP EC 3 .4.11.1Morpholine-Citric acidAspartate aminotransferase AAT EC 2 .6.1.1Morpholine-Citric aci极 ,依次用 1 ,2 ,……表示各个位点 ,对每个位点的不同等位基因 ,从阳极到阴极 ,依次用 a,b,c,……表示。在跑每一块胶时 ,控制电泳条件 ,温度和电泳时间基本相同 ,使不同胶上的酶谱具有可比性 ,最后对不同基因型的材料 ,再选出具代表性的放在同一块胶上电泳 ,以确定等位基因的数目。根据各个居群等位基因的组成和频率 ,计算下列遗传变异度量指标 :多态位点百分数 P(采用具两个以上等位基因 ,且最常见等位基因频率等于或小于 0 .99的标准 ) ;每个位点的等位基因平均数 ( A) ;平均预期杂合度 H e,平均观察杂合度 H o,统计量 F,包括亚群体的固定指数 FIS,总群体的固定指数 FIT,亚群体间的基因分化比率 FST(相当于基因分化系数 GST) ;以 p- distance公式计算遗传距离D。 2 结 果实验获取了 8个酶系统共 1 5个等位基因位点的资料 ,其中 6个为多态位点 ,编码多态位点的等位基因和居群中的各种基因型模式见图 1。图 1 等位酶谱带的多态位点、等位基因 (X)及居群中的各种基因型 (XX)模式Fig1 Allozym e bands and the relevant polymorphic loci and alleles and the genotypes from populations sam ples 菘蓝种内不同栽培居群的多态位点百分数 P为 1 3.3%～ 33.3% ,每个位点的等位基因平均数 A为 1 .1～ 1 .5,平均观察杂合度 H o为 0 .0 1 5～0 .0 70 ,平均预期杂合度 H e为 0 .0 2 7～ 0 .1 0 9。 H e又叫基因多样性指数 ,可反映群体等位基因的丰富程度 ,表明如果随机交配 ,存在 2 .7%～ 1 0 .9%的杂合体 (表 1 )。基因分化系数 (表 3)可以衡量群体的分化程度。亚群体基因分化比率的平均值为 0 .0 82 ,表明二倍体菘蓝群体间存在 8.2
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