氧化修饰型低密度脂蛋白(OX-LDL)是动脉粥样硬化(AS)发生发展的危险因素之一,通过 多种环节导致沉积脂质的泡沫细胞的形成<1,2>。许多流行病学资料表明VE、βC可显著降 低血浆LDL水平和脂质过氧化物水平,抑制体内脂质过氧化反应<3～7>,推测VE、βC通 过降低体内LDL的氧化修饰程度从而达到其抗AS的作用。本次研究着重观察VE、βC对Cu 2+氧化修饰的低密度脂蛋白的影响,试图寻找VE、βC抗AS的可能作用机理及最佳剂量,为 防止AS的发生发展提供科学参考。1 材料与方法1.1 材料LDL由上海生物制品所提供, 生育酚(α-tocopherol)、全反式β-胡萝卜素(all-trans-β-car otene)均购自Sigma公司,琼脂糖由上海东海制药厂提供。1.2 LDL的氧化修饰 用PBS(pH7.4)调节LDL浓度使之成为1mg/ml,加入无菌CuSO4,使Cu2 +终浓度为10μmol/L,置37℃水浴3、6、12、24小时,修饰后的LDL加EDT A至终浓度1%以终止LDL的氧化修饰。βC(0.5、1.0和2.0μmol/L)、VE (40、100和200μmol/L)分别在加硫酸铜之前加入反应体系。同时设立一阳性对照 组不添加VE和βC。1.3 LDL氧化修饰的测定硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)采用 改良的Schuh法测定。琼脂糖电泳、荧光物质扫描采用常规方法进行。1.4 统计分析测定 结果以x±s表示,均数比较采用t检验。2 结果2.1 不同浓度VE、﹀C对TBARS 的影响如表1所示,与阳性对照组相比,随时间延长,VE、βC均可使TBARS减小,VE1 00、200μmol/L在3小时即达显著抑制作用,40μmol/L小于12h时才可降低 TBARS。同一时间点上随浓度增大TBARS减小,均以200μmol/L降低作用最强, 可见VE可以抑制TBARS的产生,并随剂量增大抑制作用加强。而βC却不同,随剂量增大抑 制作用减弱,各时间点上均以0.5μmol/L效果好。2.2 不同浓度VE、﹀C对LDL 电泳迁移率的影响如表2所示,与阳性对照组相比VE、βC均可明显减小LDL电泳迁移率,V E随浓度增大抑制作用加强,以100、200μmol/L作用好;βC随浓度增大抑制作用减 弱,以0.5μmol/L作用好。2.3 不同浓度VE、﹀C对荧光物质的影响如表3所示, 与阳性对照组相比,VE对荧光物质无明显作用,βC0.5、1.0μmol/L剂量组24h 时与阳性对照组相比显著降低,而2.0μmol/L剂量组无显著差异。表1 不同浓度VE、 ﹀C对Cu2+诱导LDL氧化修饰TBARS的影响nmol/mg试剂浓度(μmol/L) 3h6h12h24hVE阳性对照44.21±3.339.84±6.130.57±4.6 23.36±2.14029.42±1.723.67±9.015.38±1.5(1)10 .52±2.9(1)10014.33±1.4(1)11.41±3.9(1)9.70±2 .1(1)9.11±1.3(1)20015.38±1.5(1)9.30±0.7(1)8 .33±1.6(1)8.11±0.7(1)βC阳性对照44.21±3.339.84±6 .130.57±4.623.36±2.10.529.08±3.117.33±2.0(1 )5.63±1.6(1)4.33±1.4(1)1.037.89±8.321.98±2. 012.56±4.3(1)11.11±2.5(1)2.039.56±5.929.80± 1.821.96±5.721.78±1.6 注:(1)与阳性对照组相比P<0.05表 2 不同浓度VE、﹀C对Cu2+诱导氧化修饰的LDL电泳迁移率的影响Rf试剂浓度(μm ol/L)3h6h12h24hVE阳性对照4.0±0.34.0±0.34.2±0.23 .9±0.2403.9±0.22.7±0.31.6±0.11.3±0.1(1)1002 .9±0.42.1±0.30.8±0.1(1)0.9±0.1(1)2001.9±0.2 1.2±0.1(1)0.8±0.1(1)0.8±0.2(1)βC阳性对照4.0±0.3 4.0±0.34.2±0.23.9±0.20.53.0±0.62.1±0.1(1)2. 3±0.3(1)0.9±0.1(1)1.03.8±0.33.1±0.22.9±0.22 .2±0.1(1)2.03.8±0.13.3±0.42.8±0.32.4±0.2 注 :(1)与阳性对照组相比P<0.05表3 不同浓度VE、﹀C对荧光物质的影响nmol/ mg试剂浓度(μmol/L)3h6h12h24hVE阳性对照121.3±10.1112 .6±9.891.4±6.796.7±8.940107.2±12.181.3±5.17 8.5±8.281.3±1.910099.0±3.375.8±21.284.0±8.4 92.2±7.020099.0±6.785.4±7.777.16±10.290.8±3 .3βC阳性对照121.3±10.1112.6±9.891.4±6.796.7±8.9 0.5119.5±26.190.81±3.392.2±3.974.4±3.3(1)1. 0114.0±18.9100.4±5.196.3±5.175.8±1.9(1)2.01 26.3±20.293.5±3.997.6±5.186.7±3.3 注:(1)与阳性 对照组相比P<0.053 讨论近年来氧化修饰型低密度脂蛋白(OX-LDL)在动脉粥样硬 化(AS)发生发展中的作用已肯定,LDL与动脉壁的细胞或重金属离子如铜离子(Cu2+) 一起孵育,均可导致氧化修饰型低密度脂蛋白(OX-LDL)的产生,已证实该种修饰的LDL 可以导致细胞内胆固醇脂的聚集<8>。而抗氧化营养素可显著降低血浆LDL水平和脂质过氧化 水平,抑制体内脂质过氧化反应。本实验观察到VE、βC均可抑制Cu2+诱导的LDL氧化修 饰,并存在一定的量-效关系,随着剂量的增大,VE抑制LDL氧化修饰的作用加强而βC的作 用减弱,究其原因可能是βC浓度越高,其自身氧化速率越快,产生的代谢物进一步产生一些活性 氧自由基,促进LDL进一步氧化,从而减低了βC的抗氧化性。有文献报道LDL上负载过多的 βC(增加16～35倍)并不能提高LDL的抗氧化能力<10>,Kara报道βC增加肺癌 发病率<11>,揭示我们对于βC的应用存在一个适宜的剂量问题。尽管VE、βC均为有效的 脂溶性抗氧化剂,但二者对Cu2+氧化修饰LDL的抑制机理可能并不相同,Cu2+所诱导的 LDL氧化修饰,是通过自由基引发的脂质过氧化反应,在脂质过氧化反应中,LDL上的卵磷脂 在卵磷脂酶A2的作用下生成溶血卵磷脂和多聚不饱和脂肪酸,后者在氧自由基的作用下被氧化, 烯键被破坏,产生丙二醛等脂质过氧化物(TBARS)。同时磷脂水解、载脂蛋白B(Apo- B)降解等使LDL结构发生变化,生成的醛类物质与Apo-B中一些游离氨基结合导致其负电 荷增加,表现在琼脂糖电泳时电泳迁移率加快。比较VE、βC对Cu2+氧化LDL的影响可以 发现,VE对TBARS的影响要比βC小,而对Rf的影响则要比βC大。推测二者通过抑制L DL氧化的不同环节而发挥各自的抗氧化特性。总之,通过补充一定剂量VE、βC是保护LDL 免于氧化修饰的一条有效途径,这对于膳食补充VE、βC以减少Ox-LDL的产生,进而抑制 AS的发生发展可提供参考不同水平维生素E和β-胡萝卜素对Cu~(2+)氧化修饰低密度脂 蛋白的影响@成晓龙$山西医科大学生化与分子生物教研室!太原030001@崔永萍$山西医 科大学生化与分子生物教研室!太原030001@陈彦球$山西医科大学生化与分子生物教研室 !太原030001@张喜忠$山西医科大学生化与分子生物教研室!太原030001维生素E ;;β-胡萝卜素;;铜离子;;低密度脂蛋白;;氧化修饰研究不同浓度的维生素E(VE)和 β-胡萝卜素(βC)对Cu2+诱导的氧化修饰低密度脂蛋白(LDL)作用的影响,通过测定 硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)、LDL的电泳迁移率(Rf)以及荧光物质(Lipof usin)扫描,反映LDL的氧化修饰程度。结果表明:VE、βC均可减少TBARS的产生 、减小LDL的Rf,并且具有剂量-效应关系,随浓度增加,VE抑制作用加强而βC抑制作用 减弱,而且VE对TBARS的影响比βC小,对Rf的影响比βC大。二者对荧光物质均有降低作用,但无剂量-效应关系。提示VE、βC均可不同程度的抑制Cu2+氧化修饰LDL的作用,在降低机体脂质过氧化反应、减少氧化修饰型LDL(OX-LDL)的形成方面具有重要作用,但二者作用机理可能并不相同1 Steinberg D,Witztum JL .Role of oxidized low density lipoproteinin atherogenesis.JClin Invest,1991,88:1785 -92
2 Jialal I,Michael A,Diane W.β-carotene inhibits the oxidativemodification of low density lipoprotein. Biochim Biophy Acta,1991,10 86 :134-8
3 Steinberg D. Lipoproteins and atherogensis. ArteriosclerosisThromesis.1994,14 (7) :116 2 -9
4Steinberg D,Steinbrecher UP,Parthasarathy S.Modificat
More abstracts about the 不同水平维生素E和β-胡萝卜素对Cu~(2+)氧化修饰低密度脂蛋白的影响