中药材采集后不及时干燥或贮存不当或在制备和加工过程中处理不善 ,可能污染各种霉菌并产生真菌毒素 ,其中黄曲霉毒素 B1(AFB1)毒性最大 ,致癌力最强 ,文献报道用间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)检测中药材和中成药的 AFB1,检出率极高 ,而且含量也很高<1,2 > 。为了更客观地评价中药材的 AFB1污染程度 ,保证人民用药安全 ,我们采用了ELISA试剂盒定量检测 AFB1,对一批中药材和中成药进行检测。1 仪器、试剂、药材酶联免疫测定仪 (Bio Rad- 550 ) ,AFB1(ELISA)检测试剂盒 (北京市营养源研究所百林生物技术公司 ) ,其组成 :1 AFB1抗原包被 1 6孔× 6条形带框酶标板 ,2单克隆抗体 ,3酶标二抗 ,4空白对照液 ,5底物 (1 mg× 4) ,6底物液 A,7底物液 B,8终止液 ,9PBS- T洗液。中药材样品来源于海淀医药经营公司 ,中成药为市售品。2 原理样品中的 AFB1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应 ,多余的游离抗体与酶标板内的包被抗原结合 ,加入酶标记物和底物后显色 ,与标准曲线比较测定含量。3 样品测定3.1 提取 :样品粉碎过 2 0目筛 ,取 2 0 .0 g加入2 50 m L具塞锥形瓶中 ,准确加入 50 .0 m L 甲醇 -水(80∶ 2 0 )溶液和 1 5.0 m L 石油醚 ,盖塞后滴水封严。超声 30 min,用快速定性滤纸过滤于 1 2 5m L分液漏斗中 ,待分层后 ,放出下层甲醇 -水溶液于 50m L烧杯中 ,从中取出 1 0 .0 m L (相当于 4.0 g样品 )于 75m L蒸发皿中 ,65℃水浴通风挥干 ,用2 .0 m L2 0 %甲醇 - PBS分 3次溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物 ,移至小试管 ,加盖振荡后静置待测 ,此液每 1 m L相当于 2 .0 g样品。3.2 ELISA测定1将下列试剂稀释后备用 :PBS- T洗液 :390m L蒸馏水稀释 (1∶ 40 ) ;底物液 A:9m L蒸馏水稀释 (1∶ 9) ;抗体 :7m L蒸馏水稀释 (1∶ 1 40 ) ;酶标二抗 :1 0 m L 蒸馏水稀释 (1∶ 2 0 0 ) ;阴性对照液 :2 0 0 μL 抗体 +2 0 0 μL 空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。2抗体抗原反应 :抗体与等量样品提取液混匀后静置 1 5min。洗涤酶标板 2次 (每次 3min) ,晾干。分别加入此抗体抗原反应液及空白对照液、阴性对照液 ,1 30微升 /孔 ,37℃湿盒中孵育 ,2 h后倒掉反应液并晾干 ,洗 3× 3min,晾干。3酶标记反应 :加入酶标二抗 ,1 0 0微升 /孔 ,37℃孵育 1 h,洗 5× 3min,晾干。4显色反应 :1 mg底物 +2 .5m L底物液 A+42μL底物液 B,待底物充分溶解后加入酶标板 ,1 0 0微升 /孔 ,37℃ 1 5min后加入终止液 ,40微升 /孔。5测定 :酶标仪 490 nm测定吸收值。3.3 计算1求出各孔的吸收校正值 :吸收校正值 =吸收实测值 -空白对照孔吸收值 (均值 )。2求出待测样的吸收值 :吸收 (% ) =<吸收校正值÷阴性对照孔吸收校正值 (均值 ) >× 1 0 0 %。3求出待测样 AFB1含量 (ng/g) :将待测样的吸收 (% )值带入标准竞争抑制曲线 ,算出 AFB1含量。结果见表 1。4 讨论ELISA法检测限达 0 .0 1 ng,操作比较简单 ,样品不用经过纯化是其优越性。本文所用试剂盒为单表 1 中药材和中成药的 AFB1 含量药材名称 AFB1 含量 (ng/g) 药材名称 AF B1 含量 (ng/g) 神曲 49.3山楂 2 8青皮 2 5 .7白术 15白芍 2 .3黄芩 16 .9泻叶 10 0麦冬 0黄芪 2 0 0胖大海 19陈皮 10 6枳实 2 3.5柴胡 10续断 44.7丹皮 2 .5姜黄 17地丁 14 .6茯苓 0金钱草 12银翘解毒丸 2 9.5板蓝根 10 0清眩治瘫丸 2 3.7克隆抗体 ,与文献所用多克隆抗体方法的检测结果相比 ,所测中药材和中成药的 AFB1含量低得多 ,但据了解该试剂盒的单克隆抗体未检验过中药成分 ,尚需证实含香豆素或黄酮类化合物的中药对检测AFB1有无干扰ELISA试剂盒定量检测中药 材和中成药的黄曲霉毒素B_1$中国协和医科大学中国医学科学院药用植物研究所!北京100094@李延生
$中国协和医科大学中国医学科学院药用植物研究所!北京100094@陈建民中药材;;中成药;;黄曲霉毒素B_1;;ELISA试剂盒为评价中药材和中成药的黄曲霉毒素 B1 (AFB1 )污染程度 ,采用了 EL ISA试剂盒定量检测 AFB1 ,对一批中药材和中成药进行检测 ,发现 AFB1 检出率和含量很高1 杜平华 ,杨晓峰 .药物分析杂志 ,1995 ,15 :(2 ) :34
2 任凤兰 ,马宏伟 .药物分析杂志 ,1997,17:(4) :2 80
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