以111ＩｎＤＴＰＡ奥曲肽(ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ,一种生长抑素的8肽类似物)为代表的肿瘤 生长抑素受体显像剂,对生长抑素受体阳性的肿瘤,特别对神经内分泌肿瘤以及某些非神经内分泌 肿瘤的阳性检出率可达80%以上;可检出一些ＣＴ和ＭＲＩ未能发现的肿瘤,并可预示用生长抑 素或其类似物治疗的有效性<1>。但111Ｉｎ系加速器生产,成本高,不易获得。因而研制9 9Ｔｃｍ标记ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ作为肿瘤生长抑素受体显像剂具有一定的临床意义。本文报道 了99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ的制备、鉴定及临床前药理研究的结果。材料和方法一、99 Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ的制备国家自然科学基金资助项目(39470219)作者单位: 610041 成都,华西医科大学第一附属医院核医学科(第一作者现在四川省肿瘤医院核医学 科,成都,610041)1材料。Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ系市售临床用注射剂(Ｓａｎｄｏｚ公 司,瑞典);抗坏血酸钠为Ｓｉｇｍａ公司产品,其余化学试剂均为国产分析纯或化学纯。99Ｍ ｏ99Ｔｃｍ发生器,中国核动力研究设计院第一研究所生产。2标记方法。按一定比例在标记反 应体系中分别改变下列因素:反应总体积、ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ加入量、抗坏血酸钠和连二亚硫 酸钠加入量、ｐＨ值、反应温度以及甘氨酸、肌醇和水合四硼酸钠3种化合物加入与否以及只加其 中1种化合物,进行正交设计实验,经统计学多因素方差分析,从而筛选出最佳标记条件:甘氨酸 、肌醇、水合四硼酸钠各2ｍｇ,预先装入小瓶中,然后加入新鲜配制1ｍｏｌ抗坏血酸钠溶液2 0μＬ,连二亚硫酸钠溶液20μＬ(溶于001ｍｏｌＬｐＨ值65醋酸钠溶液,50ｍｇｍＬ ),再加入100μＬｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ溶液(含ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ10μｇ)和所需放 射性活度的新鲜淋洗液99ＴｃｍＯ-4,反应体系ｐＨ值48,用质量分数为09%ＮａＣｌ调 至05ｍＬ,反应混和物置沸水浴15ｍｉｎ完成标记。3纯化。标记物纯化采用ＯＡＳＩＳＴＭ ＨＬＢ小柱(Ｗａｔｅｒｓ公司)以去除未结合99Ｔｃｍ。二、99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄ ｅ鉴定1放化纯。选用以下2个系统进行硅胶Ｇ薄层层析。系统Ⅰ:饱和盐水作展开剂,标记肽和 还原99ＴｃｍＲｆ=00～01,游离99ＴｃｍＲｆ=10;系统Ⅱ:吡啶∶体积分数36% 醋酸∶水=5∶3∶15作展开剂,还原99ＴｃｍＲｆ=00～01,标记肽和游离99Ｔｃｍ Ｒｆ=10。2稳定性实验。①纯化后99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ室温下放置4ｈ,观察放 化纯变化。②纯化后99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ与过量ＤＴＰＡ、人血清白蛋白(ＨＳＡ) 、半胱氨酸(物质的量比1∶100)37℃保温4ｈ,观察放化纯变化。3无菌无热原实验。样 品微生物学检查进行需氧菌、厌氧菌和霉菌实验。热原检查采用鲎试验(依照《中华人民共和国药 典》1995年版附录ⅪＥ细菌内毒素检查法)。4毒性安全实验。10只Ｗｉｓｔａｒ大鼠尾静 脉注射成人剂量1000倍的标记物后,观察急性毒性反应及7ｄ存活情况。5动物体内分布实验 。正常Ｗｉｓｔａｒ大鼠尾静脉注射99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ,于不同时间处死,测定各 器官组织的放射性,结果以每克组织放射性占注射剂量百分比(%ＩＤｇ组织)表示。6动物药物 动力学实验。Ｗｉｓｔａｒ大鼠尾静脉注射标记肽后,不同时间采血,测定其放射性,通过计算机 处理数据,获得药物动力学参数。7体外受体介导结合特性研究。采用自行制备的大鼠脑皮质细胞 膜进行研究。大鼠脑皮质细胞膜制备参照文献<2>方法,经考马斯亮蓝法测定,其膜蛋白浓度为 032ｇＬ。首先,对影响膜受体结合反应诸因素进行正交实验,建立最佳膜受体结合反应条件( 另文报道)。其膜受体结合反应的重复性较好,同一细胞膜同一次结合实验中组间ＣＶ1为108 %,同一细胞膜不同天进行结合实验的ＣＶ2为135%;非特异性结合(ＮＳＢ)为108%; 最大结合率为369%。在以上研究基础上进行体外受体介导结合特性研究。①饱和实验:细胞膜 量固定,标记肽逐级增加,测得结果以标记肽量为横坐标,以特异性结合计数率为纵坐标,作饱和 曲线。②竞争抑制实验:细胞膜和标记肽量固定,非标记肽量逐级增加,测得结果作竞争抑制曲线 。③对照物99Ｔｃｍ催产素(ｏｘｙｔｏｃｉｎ)的制备和体外受体结合实验:由于因ｏｘｙｔ ｏｃｉｎ与ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ分子质量相近,含双硫键,但是不与生长抑素受体特异性结合, 故采用99Ｔｃｍｏｘｙｔｏｃｉｎ作为99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ的对照物,以进一步验 证后者的受体介导结合特性。99Ｔｃｍｏｘｙｔｏｃｉｎ的制备和体外细胞膜受体结合实验与9 9Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ相同。三、临床受体显像仪器采用ＳＰＥＣＴ仪(ＨＥＬＩＸＸＥ ｌｓｃｉｎｔ),配接大视野低能平行孔准直器,能量选择140ｋｅＶ,窗宽10%。1正常人 受体显像。①药物动力学:正常人1例,静脉注射99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ370ＭＢｑ 后立刻连续动态采集,以心脏作为感兴趣区(ＲＯＩ),获得不同时间ＲＯＩ内像素点(ａ)的平 均计数,通过计算机处理数据。②静态显像:正常人1例,静脉注射99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉ ｄｅ370ＭＢｑ后分别于05、1和2ｈ进行全身静态显像,全身分5节段采集,每节段采集1 20ｓ。2肿瘤受体显像。肺癌3例,均经ＣＴ、骨显像、组织学检查或手术证实。其显像方法同 上。结 果一、99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ的制备和鉴定1放化纯。检测5批样品99Ｔ ｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ,放化纯达786%～795%,纯化后>938%。2稳定性实验。 检测3批样品,纯化后99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ室温下放置4ｈ,放化纯达921%～9 26%,与放置前差异无显著性,表明有较好的体外稳定性。3批样品检测,纯化后99Ｔｃｍｏ ｃｔｒｅｏｔｉｄｅ分别与过量ＤＴＰＡ、ＨＳＡ、半胱氨酸(物质的量比1∶100)37℃保 温4ｈ,放化纯均在928%～936%之间,表明螯合在ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ上的99Ｔｃｍ 较稳定,推测99Ｔｃｍ不仅在体外甚至在体内亦不易与ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ解离。3无菌无热 原实验。样品微生物学检查,需氧菌、厌氧菌、霉菌实验均阴性;热原检查、鲎试验阴性。4毒性 安全实验。10只Ｗｉｓｔａｒ大鼠经尾静脉注射成人剂量1000倍的样品后,无急性毒性反应 ,观察7ｄ全部存活。5动物体内分布实验结果见表1。从表1可见,血、心放射性呈“双峰”现 象,即4ｈ放射性较低,而前后时间点较高,可能系99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ在体内与受 体结合后重新释放入血之故。脑皮质放射性仅次于肾、心、血,高于脾、肝、小肠、肺等其他组织 ,表明表1 99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ动物体内分布实验(ｘ±ｓ)%ＩＤｇ组织 注药后时间(ｈ)0514824血248±083240±045086±004276±08 0139±005心103±008103±002071±001155±007111±00 7肺051±005092±051054±015034±006040±001肝040±0 07043±012026±004020±002032±003脾062±010109±0 49132±040058±029082±004肾255±103172±045126±0 07151±033253±003小肠038±003089±044042±001053± 013040±002脑皮质168±012172±011165±025165±04515 5±034 注:鼠数3只Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑皮质生长抑素受体有较高表达。肾脏放射性 最高,一方面可能与肾脏组织表达生长抑素受体有关<3>,另一方面系99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏ ｔｉｄｅ经泌尿系统排泄。6动物药物动力学实验。Ｗｉｓｔａｒ大鼠药物动力学符合二室开放模 型,ｔ12α=9ｍｉｎ,ｔ12β=176ｍｉｎ,ｔ12α<ｔ12β,示99Ｔｃｍｏｃｔ ｒｅｏｔｉｄｅ分布快,消除慢。7体外受体介导结合特性研究。1)饱和实验:特异性结合(Ｓ Ｂ)的结合量随99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ量增加而增加,但增加的幅度逐渐减低,呈饱和 趋势。ＮＳＢ随99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ量的增加呈直线上升,无饱和趋势。作Ｓｃａｔ ｃｈａｒｄ分析,ｒ=-09383,亲和常数ＫＤ=082ｎｍｏｌＬ,最大受体结合容量Ｂｍ ａｘ=786ｎｍｏｌＬ。2)竞争抑制实验:以ＳＢＴ为纵坐标,非标记ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ 浓度为横坐标绘制竞争抑制曲线(图1)。随着非标记ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ在反应体系中的浓度 逐渐增加,99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ结合率逐渐降低,表明非标记ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ 能有效抑制99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ与脑皮质细胞膜的结合,二者结合活性无明显差异。 3)对照物99Ｔｃｍｏｘｙｔｏｃｉｎ的制备和体外受体结合实验:99Ｔｃｍｏｘｙｔｏｃｉ ｎ放化纯为768%,纯化后为929%,室温下放置4ｈ后为918%。体外结合实验结果表明 ,99Ｔｃｍｏｘｙｔｏｃｉｎ无饱和曲线,成一直线趋势,也无竞争抑制结合。二、临床受体显 像1正常人显像。①药物动力学:数据经计算机处理后,正常人药物动力学符合二室开放模型,ｔ 12α=21ｍｉｎ,ｔ12β=170ｍｉｎ,ｔ12α<ｔ12β,表明标记肽在正常人体内 分布很快,消除较慢,与动物实验结果基本一致。②显像特点:注药后05ｈ全身轮廓清晰,可见 四肢大血管显影,心、肾显影较浓,肝、双肺显影较淡;1ｈ心影开始减淡,肾影仍较浓,肝、双肺影未见明显变化;2ｈ心影、肝影、双肺影均减淡,肾影最浓。膀胱05～2ｈ均显影。观察时间内甲状腺、胃始终未显影(图2)。2肿瘤受体显像。3例肺腺癌患者中,1例原发灶已行手术切除,2例未切除,均有较广泛骨转移或肝转移。99Ｔｃｍｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ显像,原发灶
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