硫酸氯吡格雷是继盐酸噻氯吡啶之后又一个抗血小板新药 ,主要用于治疗脑梗塞、心肌梗死等动静脉血栓、以及与血小板集聚相关的疾病 ,其疗效及安全性均优于现有药物盐酸噻氯匹定及阿司匹林。本研究旨在观察氯吡格雷对大鼠血小板聚集功能及对动静脉血栓形成的影响。1 实验材料1.1 药物及试剂 硫酸氯吡格雷 (简称氯吡格雷 ,白色粉末 ,由本院合成二室提供 ,批号 9710 0 4 ,含量98.63% ) ,临用前以蒸馏水配制成 0 .0 6,0 .2 ,0 .6,2 ,6ｍｇ/ｍｌ的药液供大鼠灌胃用 ;盐酸噻氯匹定 (简称塞氯匹定 ,ＳＩＧＭＡ公司 ,批号 6665Ａ ,含量 >99% ) ,临用前以蒸馏水配制成 6ｍｇ/ｍｌ的药液供大鼠灌胃用 ;ＡＤＰ、花生四烯酸 (ＳＩＧＭＡ公司 ) ;胶原 :称取大鼠腹部去毛皮肤 1ｇ ,加入 10ｍｌ生理盐水 ,于冰水浴中研磨 ,3 0 0 0ｒ/ｍｉｎ离心 10ｍｉｎ后取上清液 ,此上清液再以 80 0 0ｒ/ｍｉｎ离心 10ｍｉｎ ,第 2次离心得的上清液制得 10 0ｍｇ/ｍｌ母液备用1 .2 动物 Ｗｉｓｔａｒ大鼠 :天津药物研究院实验动物室提供。2 方法与结果2 .1 对实验性动脉血栓形成的影响 雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 ,体重 ( 2 87± 32 )ｇ ,按体重随机分为 5组 ,每组10只。分别灌服蒸馏水 (对照组 ) ,氯吡格雷 1,3,10ｍｇ/ (ｋｇ·ｄ) ,噻氯匹定 30ｍｇ/ (ｋｇ·ｄ)× 3ｄ ,给药体积均为 0 .5ｍｌ/ 10 0 ｇ ,于末次给药后 2ｈ ,以 2 0 %乌拉坦 1ｇ/ｋｇ腹腔麻醉 ,仰卧位固定 ,分离颈总动脉 ,并将ＢＴ87- 2型实验性体内血栓形成仪的刺激电极和温度探头钩上 ,刺激时间 4ｍｉｎ ,刺激强度 2ｍＡ ,记录动脉血栓形成的时间。结果见表 1。表 1 氯吡格雷对大鼠血栓形成及血小板聚集率的影响 ( ｘ±ｓ)药 物 剂 量ｍｇ/(ｋｇ·ｄ)实验性动脉血栓形成时间 (ｓ)血小板聚集率 ( % )ＡＤＰ花生四烯酸胶 原动静脉旁路血栓 (ｍｇ)湿 重干 重实验性静脉血栓干重 (ｍｇ)蒸馏水 - 710± 9561.2± 13 .2 71.7± 10 .3 63 .5± 8.0 2 8.3± 8.7 8.1± 1.64 .8± 2 .0氯吡格雷 0 .3 2 .0± 0 .6ａ1895± 2 17ａ 3 6.3± 18.8ｂ 4 4 .8± 19.8ｂ 3 6.9± 2 1.3ｂ 2 2 .0± 3 .7ａ 7.6± 0 .91.7± 1.0 ｂ3 915± 2 13ａ 2 7.4± 12 .2 ｃ 3 2 .1± 2 3 .6ｃ 3 6.2± 17.9ｃ 19.4± 4 .4 ｂ 6.4± 1.5ａ 1.0± 0 .6ｃ10 1184± 4 77ｃ 2 4 .2± 14 .0 ｃ 3 3 .3± 19.9ｃ 3 2 .5± 14 .1ｃ 17.3± 4 .8ｂ 5.7± 1.6ｂ3 0 13 .4± 6.1ｃ 5.1± 1.2 ｃ噻氯匹定 30× 3 1159± 365ｃ 2 8.4± 15.2 ｃ 50 .5± 2 0 .1ａ 4 0 .8± 11.5ｃ 18.1± 3 .0 ｂ 5.6± 1.4 ｃ 1.9± 0 .9ｃ 与空白对照组相比 ,ａ:Ｐ <0 .0 5,ｂ :Ｐ <0 .0 1,ｃ:Ｐ <0 .0 0 1 结果表明 ,大鼠灌服氯吡格雷 1,3,10ｍｇ/ (ｋｇ·ｄ)后 ,与对照组比较动脉血栓形成时间分别推迟2 6% ,2 9% ,67% ,呈一定的量效关系 ,表明氯吡格雷能明显延长大鼠实验性动脉血栓形成时间。阳性药物噻氯匹定抗血栓形成作用亦较明显。氯吡格雷10ｍｇ/ (ｋｇ·ｄ)对血栓形成时间的影响与噻氯匹定30ｍｇ/ (ｋｇ·ｄ)× 3的作用相当 (Ｐ >0 .0 5) ,而前者的剂量明显比后者低 ,说明氯吡格雷的抗栓效力比噻氯匹定强。2 .2 抗血小板聚集作用 取上述体内血栓形成后的大鼠 ,腹主动脉取血 ,3.8%枸橼酸钠与全血按 1∶9混合 ,10 0 0ｒ/ｍ离心 7ｍｉｎ制备富血小板血浆(ＰＲＰ) ,3 0 0 0ｒ/ｍ离心 10ｍｉｎ制备贫血小板血浆(ＰＰＰ) ,应用ＳＰＡ - 3型ＰＰＰ自动平衡血小板聚集仪 ,将各诱导剂诱导的血小板聚集百分数调至60 %～ 70 %。诱导剂ＡＤＰ、花生四烯酸、胶原终浓度分别为 4 μｍｏｌ/Ｌ ,2ｍｍｏｌ/Ｌ ,2 0ｍｇ/ｍｌ。结果见表 1。大鼠灌服氯吡格雷 1,3,10ｍｇ/ｋｇ后 ,对ＡＤＰ诱导的血小板聚集抑制百分率分别为 4 1% ,55% ,60 % ;对花生四烯酸诱导的血小板聚集抑制百分率分别为 38% ,55% ,54% ;对胶原诱导的血小板聚集抑制百分率分别为 4 2 % ,4 3% ,4 9%。表明氯吡格雷能明显抑制ＡＤＰ、花生四烯酸及胶原诱导的血小板聚集。阳性药物噻氯匹定对ＡＤＰ、花生四烯酸及胶原诱导的血小板集聚抑制作用亦较明显 ,但其作用没有氯吡格雷强。2 .3 对大鼠动静脉旁路血栓的抑制作用 健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 50只 ,体重 ( 34 7± 16) ｇ ,按体重随机分为 6组 ,每组 10只 ,分别灌服蒸馏水 ,氯吡格雷1,3,10 ,30ｍｇ/ (ｋｇ·ｄ) ,噻氯匹定 30ｍｇ/ (ｋｇ·ｄ)×3ｄ ,给药体积均为 0 .5ｍｌ/ 10 0 ｇ ,于末次给药后 2ｈ戊巴比妥钠 4 0ｍｇ/ｋｇ腹腔麻醉 ,仰卧位固定 ,气管插管。分离右颈总动脉和左颈外静脉。取内径约 1.5ｍｍ ,长约 2 5ｃｍ 3段套连的弧形聚乙烯插管 ,中段内置一根长 6ｃｍ的 4号手术线 ,以肝素生理盐水溶液( 2 5Ｕ/ｍｌ)充满聚乙烯管腔 ,将管的一端插入左颈外静脉 ,另一端插入右颈总动脉 ,然后开放血流 ,并记录时间 ,血液从动脉流经聚乙烯管 ,返回静脉。15ｍｉｎ血栓形成后阻断血流 ,迅速取出手术线 ,称血栓湿重。血栓于室温下放置 2 4ｈ后 ,称其干重。结果见表 1。大鼠灌服给予氯吡格雷 1,3,10 ,30ｍｇ/ｋｇ后 ,产生剂量相关的抗栓作用 ,与对照组比较血栓形成抑制百分数分别为 2 2 % ,31% ,39% ,53%。表明氯吡格雷能明显抑制动静脉旁路血栓的生成。阳性药物噻氯匹定抗血栓作用亦明显 ,但不如氯吡格雷强。2 .4 抗实验性静脉血栓形成作用 健康雄性Ｗｉｓ ｔａｒ大鼠 50只 ,体重 ( 30 3± 37)ｇ ,按体重随机分为 5组 ,每组 10只 ,分别灌服蒸馏水 ,氯吡格雷 0 .3,1,3ｍｇ/ｋｇ ,噻氯匹定 30ｍｇ/ (ｋｇ·ｄ)× 3ｄ ,给药体积均为 0 .5ｍｌ/ 10 0 ｇ ,于末次给药后 2ｈ戊巴比妥钠4 0ｍｇ/ｋｇ腹腔麻醉 ,仰卧位固定 ,打开腹腔 ,分离下腔静脉 ,结扎左肾静脉分支下方下腔静脉 ,并同时结扎两侧腰髂静脉及精索静脉 ,随后缝合腹壁。 3ｈ后 ,再次打开腹腔 ,在下腔静脉结扎处下方 1.5ｃｍ处穿线结扎 ,取下该段血管 ,纵向切开 ,取出血栓 ,于室温下放置 2 4ｈ后 ,称取血栓干重。结果见表 1。大鼠灌服给予氯吡格雷 0 .3,1,3ｍｇ/ｋｇ后 ,产生剂量相关的抗静脉血栓作用 ,与对照组比较抑制血栓形成百分数分别为 58% ,64% ,79%。表明氯吡格雷对大鼠静脉血栓的形成具有明显的抑制作用。阳性药物噻氯匹定抗静脉血栓作用亦明显 ,但不如氯吡格雷强。3 讨论大鼠单次静注及口服给予相同剂量 ( 10ｍｇ/ｋｇ)的硫酸氯吡格雷后 ,其时效曲线几乎平行 ,口服 2ｈ时抗聚集作用达峰值 ,并维持稳态 1～ 2ｄ。随后抑制作用下降 ,但维持显著性至少 5天。由于氯吡格雷的抗聚集作用主要是直接抗ＡＤＰ ,因此口服氯吡格雷后同样可以抑制高浓度ＡＤＰ、低浓度胶原( 1μｇ/ｍｌ)及凝血酶 ( 0 .1Ｕ /ｍｌ)诱导的血小板聚集 ,而不能抑制较高浓度的凝血酶诱导的血小板聚集 ,却仍能抑制较高浓度的胶原诱导的血小板聚集<1> 。雄性ＳＤ大鼠 ,静注组织促凝血酶原激酶 ( 7μｌ/ｋｇ) ,造成静脉停滞 ( 10ｍｉｎ) ,再结扎下腔静脉 ,于血栓形成前 2ｈ ,口服氯吡格雷呈剂量依赖性的抑制血栓形成 <ＥＤ50 =( 12 .2± 1.3) μｇ/ｋｇ>。当仅结扎下腔静脉而不静注组织促凝血酶原激酶时 ,静注或口服给予氯吡格雷能明显减少静脉血栓 ,ＥＤ50 =( 1.0± 0 .6)和 ( 2 .1± 0 .75)ｍｇ/ｋｇ。这些结果表明 ,低血栓形成的条件下 ,ＡＤＰ调解的血小板活性在静脉血栓形成中起重要作用 ,氯吡格雷对静脉血栓所产生的病理学变化具有治疗作用<2 ,3> 。以电刺激大鼠颈动脉血管 ,引起刺激部位广泛的血管壁血栓形成。管壁血栓主要由血小板和纤维组成 ,也伴有一些白细胞。于电刺激大鼠颈动脉前2ｈ口服给予氯吡格雷 ,能够较强的抑制血栓形成。呈明显的量效关系 ,ＥＤ50 =( 1.0± 0 .2 )ｍｇ/ｋｇ(ｎ =10 )。受损动脉血管镜检结果表明 :口服氯吡格雷大鼠在ｄｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚｅｄ区出现血小板沉积<4 > 。大鼠单次口服氯吡格雷 5ｍｇ/ｋｇ后 3ｈ明显减少动静脉旁路的血栓形成 (减少 33% ,Ｐ <0 .0 1)。抑肽酶对氯吡格雷抗聚集和抗血栓的作用无影响<5> 。大鼠注射四碘四氯荧光素后造成大脑中动脉阻塞 (ＭＣＡ) ,口服氯吡格雷 3,5ｍｇ/ｋｇ后 ,呈剂量依赖性的增加ＭＣＡ开放率 ,减少静注四碘四氯荧光素至ＭＣＡ血流停止时间 ,缩小大脑梗塞范围<6> 。氯吡格雷对ＡＤＰ作用的抑
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