丹参作为活血化瘀的要药，其促进骨折愈合的机理已得到体内＼体外的组织学、组织化学及超微结构 实验研究的证实’‘’。自１９９４年，我们又对丹参作了促进骨折愈合有效部位的筛选，并确定 了一个有效部位（ＲＳ９４０３），骨计量学检测（待发表资料）以及生物力学检测’‘’显示： ＲＳ９４０３可明显增加骨折处成骨细胞数量，促进类骨质的矿化；提高骨折端的力学强度。本研 究采用不脱钙的大鼠骨痴组织冰冻切片进行原位杂交”’，观察丹参有效部位（ＲＳ９４０３）对 骨折愈合过程中前胶原以及转化生长因子（ＴＧＦｈ）基因表达的影响，以在分子水平上揭示上述作用机制。材料与方法 １动物模型与组织切片制作健康成年Ｗｉｓｔａｒ大鼠 ２４只，体重（２００９土 ２０）ｇ，中国科学院上海实验动物中。Ｌ’提供，作双侧挠骨骨折模型’‘’，随机分成丹参有效 部位组（ＲＳ９４０３组）、三花接骨散组（三花组）和空白对照组（空白组），每组８只，分别 以ＲＳ９４０３、三花接骨散和生理盐水灌胃给药。术后３天、１周、２周和４周后处死取材，每 次每组２只，血肿和骨痴组织取下后，ＤＥＰＣ水配制的磷酸缓冲液（ＰＢＳ）冲去血迹，迅速置 液氮内冻存，然后，在冰冻切片机Ｌ，作６卜ｍ的连续冰冻切片，置预先硅化的涂有多聚赖氨酸的载玻片上，质量分数为４％的多聚甲醛（含０．ｌｍｏｌ／Ｌ蔗糖的质量浓度０．ｌｍｏｌ／Ｌ的 ＰＢＳ， ｐＨ７．２）室温下固定 １５ｍｉｎ， ＰＢＳ洗 ２次，各１０ｍｉｎ。质量浓度为０．Ｚｍｏｌ／Ｌ的ＨＣＩ室温下作用 １０ｍｉｎ，质量分数为 ０． １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００作用１５ｍｉｎ，含质量分数为 ０． ２％甘氨酸的 ＰＢＳ室温下孵育１０ｍｉｎ，蛋白酶 Ｋ消化 １５ｍｉｎ，含质量分数为 ０． ２％甘氨酸的ＰＢＳ室温下再孵育１０ｍｉｎ，ＰＢＳ－ｓｍｍｏｌ／ＬＭｇ－ＣＩ。洗２次，各１５ｍｉｎ，逐级酒精脱水，空气干燥。 ２探针的制备有关前胶原基因ＣＤＮＡ探针的质粒［ｐＨＣＡＬＩ（ ｌ型）， ｐＨＣＡＲＩ和 ｐＨＣＡＲ３（ １１型），ＰＨＦＳ３（ Ｉｌｌ型）〕，均由芬兰 Ｔｕｒｋｕ大学惠赠，合成方法参照有关文献”‘。 ＴＧＦ ９；寡核着酸探针的探针序列：ＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＡＡｔ由 ＤＮＡ合成仪合成。标记采用 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ公司 Ｄｉｇ标记试剂盒，方法参照试剂盒所附说明。 ３原位杂交采用非同位素Ｄｉｇ标记原位杂交，杂交及显色检测均采用 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ公司Ｄｉｇ标记检测试剂盒，方法参照试剂盒所附说明及有关文献”’。杂交阴性对照设立：（）杂交液中不加标记探针；（２）杂交前以ＲＮａｓｅ处理切片。 结果 骨折后第３天，ＲＳ９４０３组与三花组的骨折端血肿中，ＴＧＦ问 ｍＲＮＡ的表达明显高于空白组，并出现ｍ型胶原基因的表达。 在骨折第１周末，骨痴主要由未完全机化的肉芽组织、软骨骨痴以及部位沿骨折端骨膜下形成的编织 骨组成，此时Ｉｌｌ型前胶原基因的表达占主导地位，杂交阳性颗粒广泛出现于肉芽组织的成纤维 细胞样和软骨细胞样间充质细胞中。同时，ｌ型前胶原基因ｍＲＮＡ也开始在骨折端骨膜下编织骨中的成骨细胞中出现，１１型前胶原ｍｎｘｎ则在细小的软骨岛内的软骨细胞中有较高的表达。ＴＧＦ ５１表达在分化、增殖中的成骨细胞以及接近成熟的软骨细胞内较为明显，在ＲＳ９４０３组和三花组中尤为明显，与前胶原基因的表达较空白组呈同步增强趋势。 骨折第２周末，软骨骨痴占据骨折区的大部，并有部分软骨细胞趋向肥大，软骨特异性胶原——１１ 型前胶原ｍＲＮＡ与探针的杂交阳性颗粒在成熟的软骨细胞中密集出现，在肥大的软骨细胞中则较 少出现，在ＲＳ９４０３组和三花组中肥大软骨细胞明显多于空白组，１１型前胶原ｍＲＮＡ的表 达也呈显著的衰落趋势。软骨基质中，尤其在ＲＳ９４０３组和三花组的软骨基质中，一些肥大软骨细胞内出现１型前胶原基因的表达，即所谓的共有表型表达现象（ｓｈａｒｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｅｘｐｒｅｓ－ｓｉｏｎ）。而ｌ型前胶原ｍＲＮＡ的表达则明显增加，在软骨内化骨和再塑建中的 膜内化骨区中达高峰，尤其是在软骨内化骨前沿的成骨细胞中。ＴＧＦ民在进一步扩大的软骨小岛内的软骨细胞中持续高表达，尤其在ＲＳ９４０３组和三花组中。骨折第４周末，在空白组中软骨骨痴基本被骨组织替代，可见散在的ｌ型前胶原ｍＲＮＡ表达阳性的成骨细胞以及肥大软骨细胞。此时，ＴＧＦ ３；在肥大软骨细胞内表达减弱，而在成骨细胞尤其在丰满的成骨细胞内尤为显著。ＲＳ９４０３组 和三花组骨组织替代更趋完全，偶见Ｉ型前胶原ｍＲＮＡ表达阳性的成骨细胞和肥大软骨细胞。杂交阴性对照组切片均未观察到明显杂交阳性细胞。讨论 以往丹参促进骨折愈合的研究主要集中在组织。细胞水平的研究。这些研究已显示丹参的活血化瘀作 用改善了骨折愈合早期局部和全身的血液循环，为骨折的愈合创造了良好的内环境；同时，体内研 究还显示丹参能促进成骨细胞样细胞成熟，分泌胶原性物质和碱性磷酸酶，并使钙盐在胶原基质上 沉积，形成骨小结节。而这方面的研究均未作有效部位的筛选提取。ＲＳ９４０３经过严格的生物力学测试筛选，并得到骨计量学检测的印证，但作用机理尚属未知。从本结果显示，ＲＳ９４０３和三花接骨散不仅促进了骨折愈合过程不同阶段主要胶原的表达，而且 在骨折中后期，肥大软骨细胞Ｉ型胶原的表达也得到增强，还促使早期软骨细胞样细胞内Ｉｌｌ型胶原的表达。软骨细胞和成骨细胞起源于类似的；司充质细胞，一般认为它们分别进入各自的、不可逆的分化途径 ，而产生各自成熟、稳定的表型”’，而一些研究显示软骨细胞成熟的最后阶段，不论在骨痴，还 是在发育骨的生长板，出现１型胶原的合成和类骨质形成，显示所谓“成骨细胞样表型”，在体外 细胞培养和胚胎器官培养中，分化或肥大的软骨细胞形成骨组织”－‘’。这种所谓的共有表型表达只见于修复或发育组织，并随骨痴的成熟而减弱，而几乎不出现于分化较完全的组织。如果这种表型改变，是细胞转分化的一个中间相，那也为骨折后期软骨基质中成骨细胞的第二种来源 ，即除外随新生血管进入的未分化细胞之外的肥大的软骨细胞，提供了佐证。同时，这也是丹参促 进骨折愈合的一个重要调节机制，即丹参很可能增进了骨折愈合后期软骨骨痴中编织骨内成骨细胞 表型（ｌ型胶原）表达细胞的数量，而愈合早期软骨细胞内Ｉｌｌ型胶原的表达，可能是纤维细胞 向软骨细胞转化的一个中间相。这也说明在生长发育和创伤修复的特殊或应激情况下，某些细胞的特异性表型可发生改变，而且这种变化可由外界干预调控。ＲＳ９４０３、三花接骨散这类活血化瘀类方药，在促进骨折愈合方面，除了先前研究所揭示的作用 机制外，其对某些细胞表型表达改变或转分化的影响，更增加了骨折愈合不同阶段特异性胶原的表 达，是不可忽视的作用机制。因此，以往研究所显示的ＲＳ９４０３增加骨折愈合处成骨细胞数量 ’‘’，可能与此种作用机制有关，即它不仅促进了间充质细胞向成骨细胞的分化，而巨能促进软骨细胞向成骨细胞转化。从实验结果看，ＲＳ９４０３这种类似细胞分化刺激诱导作用，可能与促进ＴＧＦ民的表达有关。Ｔ ＧＦ民对骨折愈合过程具有重要的启动作用““，它加速了间充质细胞的定向分化和增殖。ＲＳ９ ４０３很可能通过对ＴＧＦ民这类生长因子的影响促进骨折的愈合。丹参有效部位对骨折愈合过程 中胶原基因表达的影响@史炜镔$上海第二医科大学附属瑞金医院上海市伤骨科研究所!上海200025
@符诗聪$上海第二医科大学附属瑞金医院上海市伤骨科研究所!上海200025
@杜宁$上海第二医科大学附属瑞金医院上海市伤骨科研究所!上海200025
@张凤华$上海第二医科大学附属瑞金医院上海市伤骨科研究所!上海200025
@张昊$上海第二医科大学附属瑞金医院上海市伤骨科研究所!上海200025丹参;;有效部位 ;;骨折愈合;;原位杂交;;前胶原观察丹参有效部位（ＲＳ９４０３）对骨折愈合过程中前胶 原、转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）基因表达模式的影响，分析ＲＳ９４０３促进骨折愈合作用 的分子机理。方法：健康成年Ｗｉｓｔａｒ大鼠２４只，作双侧桡骨骨折模型，随机分成ＲＳ９４ ０３组、阳性对照药三花接骨散组（三花组）和空白对照组（空白组），分别以ＲＳ９４０３、三花接骨散和生理盐水灌胃给药，术后３天、１周、 ２周和 ４周后处死大鼠取材，采用不脱钙的大鼠骨痂组织冰冻切片进行原位杂交，观察骨痂组织中前胶原和 ＴＧＦβ１基因的表达。结果：骨折后第 ３天，ＲＳ９４０３组与三花组的骨折端 ＴＧＦβ１ ｍＲＮＡ的表达明显高子空白组，并已出现血型胶原基因的表达。骨折第１周末，成纤维细胞和软骨细胞样细胞的Ⅲ型前胶原基因表达占主导，ＲＳ９４０３组与三花组Ⅱ、Ⅰ型前胶原与 ＴＧＦβ１基因的表达较空白组里同步增强趋势。骨折第 ２周末， Ⅰ型前胶原 ｍＲＮＡ表达明显增加，ＲＳ９４０３组和三花组中肥大软骨细胞明显多于空白组，Ⅱ型前胶原ｍＲ ＮＡ的表达呈现显著的衰落趋势。同时证实共有表型表达现象的存在，尤以ＲＳ９４０３组与三花组更为明显。骨折第４周末，软骨骨痂基本被骨组织替代。ＲＳ９４０３组和三花组骨组织替代更趋完全，偶见Ⅰ型前胶原 ｍＲＮＡ表达阳性的成骨细胞和肥大软骨细胞。结论：ＲＳ９４０３与阳性对照药三花接骨散均可调节骨折愈合过程中有关前胶原基因的表达，以促进骨折愈合，此作用可能与其对 ＴＧＦβ１基因表达的调控有关。1.徐荣辉,柴本甫,朱雅萍.丹参注射液对鸡胚额骨分离细胞培 养生长影响的组织化学观察.中西医结合杂志1991;11(11):668-670.2.符 诗聪,杜宁,史炜镔,等丹参有效部位(丹参-9403)对骨折愈合影响的生物力学实验研究中国中西医结合杂志19
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