从海洋微生物中获取的活性成分被喻为 2 1世纪开发高效、安全药物和新型酶制剂的重要资源。本课题组在完成对已有海洋碱性蛋白酶产酶菌株发酵条件和酶学性质研究的基础上 ,以原黄海杆菌作为原始菌株 ,对其原生质体经理化因素诱变处理 ,又得到一株高稳定性的新产酶菌株 ,并在淡水介质中发酵成功。海洋低温碱性蛋白酶温度适宜范围是 4～ 60℃ ,从而赋予它在加酶洗涤剂工业中的独特优势和广阔的市场前景 ( Feer G.1995)。因此 ,研究海洋低温碱性蛋白酶对生物体遗传机构的损害作用及其规律 ,预测对人类的潜在危害 ,具有重要意义。1 材料与方法1.1 材料海洋低温碱性蛋白酶由中国水产科学研究院黄海水产研究所提供 (批号 2 0 310 )。实验时配成 4 0 %、2 0 %和8%的水溶液 ;环磷酰胺 :江苏恒瑞医药股份有限公司 (批号 0 0 0 2 2 1) ;秋水仙碱由上海化学采购供应站提供 ;小牛血清 :青岛海泰生物技术有限公司 (批号 2 0 0 0 0 4 ) ;BH- 2显微镜为 OL YMPUS公司制造 ;NIH纯系小鼠 ,体质量 18～ 2 2 g,由卫生部北京生物制品所提供 ,一级标准 (合格证号为 0 1- 30 71) ;固定液 (甲醛∶冰醋酸 )由本室自配。1.2 小鼠骨髓微核试验 (王春波等 1998;中华人民共和国国家标准 .GB7919- 87 1997)雄性 NIH纯系小鼠 4 8只 ,体质量 18～ 2 2 g,随机分为 6组 :生理盐水阴性对照组 (外用 ) ;环磷酰胺 10 0 mg/kg组 ( sc) ;海洋低温碱性蛋白酶 2 0 g/ kg组 ( po) ;海洋低温碱性蛋白酶 2 0 g/ kg组 (外用 ) ;海洋低温碱性蛋白酶10 g/ kg组 (外用 ) ;海洋低温碱性蛋白酶 4 g/ kg组 (外用 )。间隔 2 4 h后各组均再次用药。各组均于第 2次给药后2 4 h处死小鼠 ,取双侧股骨 ,加压并用小牛血清挤出骨髓 ,混匀后推片 ,晾干并经甲醛固定 ,Giemsa染色。油镜下观察并计数嗜多染红细胞 ( PCE)与正红细胞 ( NRBC)的比值 ,计算 10 0 0个 PCE及带微核的细胞( MNPCE) ,以千分率表示 ,F检验统计。1.3 小鼠骨髓染色体畸变试验 (中华人民共和国国家标准 .GB7919- 871997;Fucic A.1990 )雄性 NIH纯系小鼠 4 8只 ,体质量 18～ 2 2 g,随机分为 6组 :除环磷酰胺 30 mg/ kg组 ( sc)外 ,其他组的给药剂量和设计方案同前。各组均于第 2次给药后 2 4 h处死小鼠取样。处死前 2 h,腹腔注射秋水仙碱 4 mg/ kg。取出股骨 ,用小牛血清制成骨髓混悬液 ,经 0 .0 75mol/ L KCl溶液低渗 30 min,加入新鲜配制的固定液 ,静置固定 2 0 min,离心并弃上清液 ,滴管吹打细胞沉淀物呈均匀细胞悬液 ,滴片 ,待玻片“老化”后 ,Giemsa染色。每只小鼠检查 >10 0个中期相细胞 ,观察染色体数目和结构的变化 ,对染色体进行核型分析 ,计算各组畸变细胞率 ,以 F检验进行统计。2 结果2 .1 海洋低温碱性蛋白酶对小鼠骨髓微核试验结果海洋低温碱性蛋白酶对小鼠骨髓细胞微核实验结果见表 1和图 1～ 5。从表中可以看出 ,海洋低温碱性蛋白酶外用或灌胃 NIH小鼠 ,对其骨髓细胞都没有抑制及毒性作用 ,P/ N均≥ 1。皮下注射环磷酰胺的小鼠 P/< 1,骨髓多染红细胞中微核总数为 184 ,微核率为 2 2 .97‰ ,与生理盐水阴性对照组比较 ,有非常显著性差异( P<0 .0 1)。而海洋低温碱性蛋白酶各组 ,小鼠微核率均在 4‰以下 ,与对照组微核率比较无显著性差异 ( P>0 .0 5)。表 1 海洋低温碱性蛋白酶对多染红细胞微核的影响Table 1 The effects of the marine low-temperature alkaline proteinase on the micronucleus组别 Group 剂 量Dosage(g/kg) n PCE(个 ) P/N MNPCEMN X± S(‰ )生理盐水Normal saline 880 0 0 >114 1.78± 0 .6 9环磷酰胺Cytoxan(sc) 0 .1880 0 0 <11842 2 .97± 5 .49*海洋低温碱性蛋白酶 (po)Marine low-temperature alka-line proteinase(po)2 0 880 0 0 >112 1.5 3± 0 .79海洋低温碱性蛋白酶 (外用 )Marine low-temperature alka-line proteinase(external use)2 0 880 0 0 >1 91.31± 1.1410 880 0 0 >1 2 0 .38± 0 .484880 0 0 >1 5 0 .83± 0 .6 8 注 :* P<0 .0 12 .2 海洋低温碱性蛋白酶对小鼠骨髓染色体畸变的试验结果表 2和图 6～ 11显示 ,环磷酰胺阳性组骨髓细胞染色体畸变率高达 18.32 % ,染色体出现裂隙、断裂、缺失、染色体环、粉碎以及多倍体等多种结构和数目的异常改变 ,而海洋低温碱性蛋白酶各组和生理盐水组染色体畸变率均在正常范围以内 ( <4 % ) ,与生理盐水组比较 ,差别均无显著性意义 ( P>0 .0 5)。环磷酰胺阳性组与各实验组间染色体畸变率比较有非常显著性意义 ( P<0 .0 1) ,大量的染色体出现结构和数目的异常。表 2 海洋低温碱性蛋白酶对小鼠骨髓细胞染色体畸变作用Table 2 The effectof the marine low-temperature alkaline proteinase on the chromosome aberration组 别Group剂量 (g/kg)Dosage(g/kg)n观察中期细胞数(个 )Numbers inmetaphase(cell)畸变率 (% )Chromosomeaberrationrate(% )畸变类型 Type of the chrom osom e aberration断裂Break染色体环chromasom eRing粉碎Shatter多倍体Polyploid生理盐水Narmal saline 815 95 0 .35 3 2环磷酰胺 (sc)Cytoxan 0 .0 3 8135 918.32 91715 130海洋低温碱性蛋白酶 (po)Marine low-temperature alkalineproteinase(po)2 0 81397 0 .2 2 3海洋低温碱性蛋白酶 (外用 )Marine low-temperature alkalineproteinase(external use)2 0 815 96 0 .19310 81197 0 .2 5 124815 96 0 .19123 讨论研究化学物诱发哺乳动物染色体畸变的方法很多 ,微核试验以其简便、快捷具有一定的敏感性 ,被广泛应用于遗传毒理学研究中。微核是染色体损伤的另一表现形式 ,是由染色体断裂遗落下来的断片演化而来的。当染色体受损后、缺失着丝点的染色体断片 ,到末期时被子细胞排除而形成次核 ,游离于细胞质中 ,直径约相当于红细胞直径的 1/2 0～ 1/5,故称微核。骨髓中 ,无核的幼稚红细胞 ,即嗜多染红细胞 ( PCE)数量充足 ,胞浆中微核易辨认 ,且自发微核率低 ( Maron D.M. 1983;黄幸纾等 1985)。故作者以幼稚骨髓细胞微核总数和概率的变化 ,作为检测海洋低温碱性蛋白酶诱变活性的方法。据报道 ,有些化学物质在低剂量范围内一般并不引起任何遗传物质的损伤 ,但在其达到一定剂量时 ,就可能在分子水平造成 DNA损伤或在细胞水平引起染色体畸变 (江泉观等 1991) ,故取海洋低温碱性蛋白酶最大耐受量 ( MTD)、1/2 MTD和 1/5MTD,以求获得其微核的剂量 -反应关系曲线。结果表明 ,NIH小鼠应用已知的阳性药环磷酰胺 10 0 mg/kg组 ( sc) ,P/N比值 <1,表现出环磷酰胺对小鼠骨髓细胞的抑制作用和毒性。诱发微核率高达 2 2 .97‰ ,这进一步证实试验所用动物的反应性及试验条件的可靠性。提示 :海洋低温碱性蛋白酶对 NIH纯系小鼠灌胃 2 0 g/kg和外用 2 0 g/kg、10 g/kg和 4 g/kg时 ,微核试验结果为阴性 ,P/N值均 >1,未显示出海洋低温碱性蛋白酶对小鼠骨髓细胞的抑制和毒性作用。染色体畸变是遗传毒物在细胞水平上引起的染色体损伤。在正常情况下 ,所有生物细胞中作为遗传物质载体的单元体 ,都有其特定的数目和形态结构。正常小鼠骨髓细胞染色体为 2 n( 4 6) ,这些特征保持相对恒定。如果具有染色体畸变效应的遗传毒物进入体内 ,就能造成受试动物骨髓细胞发生数量或形态结构的改变 ,引发这种畸变的可能途径为染色体断裂和有丝分裂毒作用 ( Evans H.S. 1977)。作者通过光学显微镜 ,观察小鼠骨髓细胞在有丝分裂中期相的染色体数目和形态。在用遗传毒理学试验预测对人类的危害时 ,一般认为体内试验的权重大于体外试验 ,真核生物的试验大于原核生物 ,哺乳动物的试验大于非哺乳动物 (周宗灿等 2 0 0 0 )。小鼠活体骨髓细胞染色体畸变试验是一种细胞遗传学经典分析方法 ,该
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