70年代以来 ,海洋生物酶研究引起学术界和酶制剂工业的高度重视。 80年代海洋生物酶开始付诸于生产应用。美国由海洋船蛆共生的海洋杆菌 ( TACC 39861)中获得了一种新型碱性蛋白酶 ,具有抗氧化和在复杂试剂中保持稳定的特性 ,已应用于洗衣粉和镜头清洁剂 ( Simpson B.K. 1984 ;Feller G. 1990 ;Hideto T.)。本课题组自我国栉孔扇贝共生的海洋杆菌中 ,应用酶工程技术 ,得到在室温下有较高酶活力的海洋低温碱性蛋白酶 ,p H为 9.5,最适作用 p H为 10 .5。作为洗涤剂的添加剂 ( p H为 9.5) ,其活性不被洗衣粉中螯合剂所抑制。由于人体接触海洋低温碱性蛋白酶的主要途径是皮肤 ,当评价其对人体健康的可能危害时 ,以新西兰大耳白兔为受试动物 ,进行海洋低温碱性蛋白酶不同浓度的急性皮肤刺激试验 ,多次皮肤刺激试验及眼刺激实验 ,旨在按国家标准确定海洋低温碱性蛋白酶的皮肤刺激强度和眼刺激强度。1 材料和方法1.1 材料海洋低温碱性蛋白酶均由中国水产科学研究院黄海水产研究所提供 (批号 2 0 310 ) ;新西兰大耳白兔 ,体质量 2 .30± 0 .2 7kg,购自山东省卫生防疫站 (合格证号码 2 0 0 0 0 10 0 6) ;荧光素钠由青岛大学医学院附属医院提供 ;无水酒精 ,青岛江山化学试剂厂生产 (批号 980 80 5) ;Bour s液 ,由本室自配 ;OL YMPUS显微镜 ,日本产。1.2 急性皮肤刺激实验取成年、健康、皮肤无损伤的新西兰大耳白兔 15只。雌 ( 7)雄 ( 8) ,体质量 2 .14± 0 .0 9kg,随机分为 3组 :海洋低温碱性蛋白酶水溶液 4 0 %、2 0 %和 5‰ ( p H均为 9.5)。实验前 2 4 h,将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉 ,去毛范围左、右各约 3cm× 6cm。采用自身对照设计 ,右侧均给予生理盐水作对照 ,左侧分别给予海洋低温碱性蛋白酶 ( 4 0 %、2 0 %、5‰ ) ,容量均为 1ml。纱布和保鲜膜覆盖 ,缝针固定 ,与皮肤封闭接触 4 h。试验结束后温水冲洗残留受试物。即刻观察并连续观察 14d涂抹皮肤反应。按文献方法 (中华人民共和国国家标准 GB7917- 871997;王治乔等 1997) ,进行皮肤反应积分和刺激强度评价。1.3 多次皮肤刺激实验成年、健康、皮肤无损伤的新西兰大耳白兔 5只 (雌 2只 ,雄 3只 ) ,体质量 2 .15± 0 .0 7kg。采用自身对照设计 ,按常规方法脱毛。于左、右两侧脱毛区分别给予 5‰的海洋低温碱性蛋白酶和生理盐水 (对照 ) ,容量均为0 .2 ml,每日 1次 ,连续 14d。逐日观察皮肤局部红斑和水肿反应 ,计算每天每只动物的平均积分 ,确定海洋低温碱性蛋白酶皮肤刺激强度分级。 14d后 ,将家兔处死 ,分别取下背部两侧涂抹部位的皮肤 ,以 Bour s液固定 ,梯度脱水 ,常规石蜡包埋 ,H.E染色 ,进行光镜镜检 (中华人民共和国国家标准 GB7917- 87 1997;徐叔云等 1994 )。1.4 急性眼刺激性选择健康成年新西兰大耳白兔 ,实验前 2 4 h内对受试动物眼睛进行检查 ,剔除有眼刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物。 6只新西兰大耳白兔的体质量为 2 .71± 0 .14kg。采用自身对照设计 ,分别将 1‰海洋低温碱性蛋白酶和生理盐水 ( 0 .1ml) ,滴入兔结膜囊内 ,给受试物后使眼睛被动闭合 5～ 10 s,观察给受试物后 1、6、2 4、4 8和 72 h至 7d的局部反应 (充血、水肿、畏光、分泌物等 )和恢复情况 ,按眼刺激反应评分。滴入荧光素钠 ,在裂隙灯下检查角膜透明度 ,虹膜纹理改变 ,计算出平均分值 ,与同一动物对照眼进行比较 (中华人民共和国国家标准 GB7917- 87 1997)。按上述观察时间 ,分别处死家兔 ,摘取家兔眼球固定于 10 %福尔马林液中 ,进行眼科病理组织学检查——组织包埋、切片、H.E染色 ,镜下观察角膜上皮的形态学结构 (杜单民 1998)。2 结果2 .1 急性皮肤刺激试验结果除去受试物 ,即刻观察 ,除 5‰海洋低温碱性蛋白酶组与对照组比较未见急性皮肤刺激性反应外 ,2 0 %和4 0 %海洋低温碱性蛋白酶组与对照组比较均可见不同程度的急性皮肤刺激性反应 ,皮肤出现红斑和水肿。实验期间 ,以 4 0 %海洋低温碱性蛋白酶组皮肤刺激反应最重 ,5只家兔全部出现红斑和水肿反应。 2 4 h时还有粘性物渗出 ,72 h结痂。 2 0 %海洋低温碱性蛋白酶组动物的刺激反应仅有 1/5,且为勉强可见红斑 ,4 8h消退 (见表1)。表 1 海洋低温碱性蛋白酶对白兔皮肤的急性刺激Table1 The acute dermal irritation of marine low-temperature alkaline proteinase on the New Zealand rabbits组别Group n即刻 Instance 1h 2 h 5 h 2 4h 48h 72 h红斑水肿红斑水肿红斑水肿红斑水肿红斑水肿红斑水肿红斑水肿Erythema Swelling Erythema Swelling Erythema Swelling Erythema Swelling Erythema Swelling Erythema Swelling Erythema Swelling5‰海洋低温碱性蛋白酶组Marine low-temperature alkalineproteinase(5‰ ) 5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5对照组Control group 5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /52 0 %海洋低温碱性蛋白酶Marine low-temperature alkalineproteinase(2 0 % ) 5 1/5 0 /5 1/5 0 /5 1/5 0 /5 1/5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5对照组Control group 5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /540 %海洋低温碱性蛋白酶Marine low-temperature alkalineproteinase(40 % ) 5 5 /5 5 /5 5 /5 5 /5 4/5 5 /5 1/5 3/5 1/5 2 /5 1/5 0 /5 0 /5 0 /5对照组Control group 5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5 0 /5根据皮肤刺激反应评分标准 ,分别计算其刺激强度 (见图 1)。图 1 海洋低温碱性蛋白酶对新西兰大耳白兔皮肤刺激Fig.1 The acute dermal irritation of marine low- tem perature alkaline proteinase on the New Zealand rabbit2.2 多次皮肤刺激试验结果在 5‰海洋低温碱性蛋白酶皮肤多次刺激性试验期间 ,每天观察皮肤反应 ,一直未见刺激反应 ,即皮肤未出现红斑 ,也未出现水肿 ,皮肤刺激反应积分为 0 ,最高刺激指数为 0。病理组织学检查结果表明 ,两侧的皮肤组织结构完整、层次清晰 ,实验兔中仅有 2 / 5出现棘层轻度肥厚 ,其余正常 (见皮肤图 1～ 4 )。与对照组比较 ,其未见其他组织形态学改变。2 .3 眼刺激试验结果肉眼观察 1‰海洋低温碱性蛋白酶液滴眼后 1h～ 7d,与生理盐水对照组比较 ,未见角膜、虹膜、结膜的刺激反应。应用荧光素钠在裂隙灯下检查 ,6/ 6受试动物眼睛对光反射正常 ,但角膜均呈现轻微点状着色 ,受损范围约 <1/ 4 ,2 4 h后 ,恢复正常。计算 4 d内最高总积分平均值为 1.5。眼科病理组织学结果显示 ,所有对照侧眼角膜上皮完整 (约 2～ 3层 ) ,前阻力膜完整、基质胶原纤维排列整齐 ;后阻力膜及内皮细胞未见异常。 1‰海洋低温碱性蛋白酶组 1h后 ,角膜上皮细胞部分脱落、断裂 ,表皮出现层间分离 ;6h后前述改变减轻 ;2 4 h后 ,角膜上皮脱落及表皮层间分离消退 ,角膜修复、增厚约 4～ 5层 ;4 8～72 h后 ,角膜完全修复正常 (见角膜图 1～ 10 )。3 讨论皮肤刺激是指受试物短期接触动物皮肤后产生的局部可逆性的炎症变化。皮肤刺激表现为水肿及红斑 ,评价方法由 Draize等人首次于 194 4年描述 ,现已将其列入化学物质安全性评价方法之一 ,故采用此法。在规定时间内 ,观察不同浓度的海洋低温碱性蛋白酶 ( p H均为 9.5) ,对皮肤所产生的急性刺激反应及其他不良反应(周宗灿等 2 0 0 0 )。由于动物物种不同造成了皮肤反应差异。据报道 ,皮肤反应的敏感顺序为兔 >豚鼠 >大鼠 >人 >猪 ,所以兔和豚鼠皮肤的敏感性高于人 (周宗灿等 2 0 0 0 )。故作者采用新西兰大耳白兔 ,更易确定海洋低温碱性蛋白酶的刺激反应。海洋低温碱性蛋白酶的急性皮
More abstracts about the 海洋低温碱性蛋白酶的刺激性研究