自由基医学是近 2 0年迅速发展而建立起来的一门新兴科学。自由基作为一个新发现的致病因子 ,可引起机体的衰老、老年性疾病和癌症等。因此 ,对氧自由基和抗氧化剂的研究 ,自然就成为引人注目的一个领域<1> 。抗氧化剂已应用于临床并取得一定效果。因此 ,自海洋中寻找天然抗氧化剂意义更为突出。扇贝多肽系栉孔扇贝中提取的水溶性多肽。相对分子质量为 80 0～ 1 0 0 0 D。我们的工作已表明扇贝多肽能有效地清除皮肤中的超氧负离子 (O- 2 )和羟自由基 (OH· ) ,抑制脂质过氧化 ,具有显著的抗皮肤老化作用 <2、3> 。为了进一步研究扇贝多肽对淋巴细胞的作用和扇贝多肽的成分 ,我们建立了 DEX免疫抑制病理模型并利用反相液相色谱对扇贝多肽进行了分析。1 材料与方法1 .1 试剂与仪器甲醇 (色谱纯 ) :天津市可密欧科技有限公司 ,批号 :990 5 1 7;二甲基亚砜 (DMSO) :江苏洪声化工厂 ,批号 :95 1 1 30 ;甲基噻唑基四唑 (商品名 :噻唑蓝 ,MTT) :Fluka公司 ;酶联免疫检测仪 :BIO-RAD公司 ;扇贝多肽 :中国水产科学院黄海水产研究所提供 ;高效液相色谱仪 :Beckmamn公司 ,带 1 6 8二级管阵检测器 ,1 2 5双溶剂微量泵 ;UV2 6 0 -型紫外可见光束自动分光光度计 :日本岛津。1 .2 方法1 .2 .1 淋巴细胞损伤病理模型的建立与 PCF对淋巴细胞的保护作用无菌小鼠脾脏和胸腺 ,分别剪碎后过网 ,利用常规方法分离淋巴细胞 ,制成 1× 10 9· L- 1的细胞悬液 ,并用台盼蓝染色 ,观察其细胞活度 <4 > 。将细胞悬液置入 2 4孔培养板中 ,每孔1 m L。分 3组 ,每组 3个复孔。第 1组为对照组 ,加入 1 6 40培养液 ;第 2组为地塞米松 (DEX)组 ,加入 DEX(1 0 - 9mol·L- 1) ;第 3组为 DEX+ PCF组 ,加入 DEX (1 0 - 9mol· L- 1)和 PCF(1 % )。在加入 MTT液 1 0 0 u L,4h后 ,终止培养 ,吸出培养上清液。对悬浮细胞 ,离心(1 0 0 0 rpm,5 min) ,弃去孔内的培养液。每孔加入 1 5 0 u L DMSO,振荡 1 0 min使结晶物充分溶解。选择 490 nm波长 ,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值 ,记录结果。1 .2 .2 反相液相色谱分析1 .2 .2 .1 色谱条件 :采用 Ultraphere ODS-C1 8(4 . 6 mm× 2 5 0 mm,ID5 μm)色谱柱 ;检测波长 :2 70 nm;柱温 :室温 ;进样量 :5 ul;流动相 :甲醇和水进行梯度洗脱 (表 1 ) ;流速 1 . 0m L· min- 1。Table 1:The washing process of flowing phaseTime( min)Methanol( m L )Water( m L )0 90 104 982810 0 01 .2 .2 .2 UV扫描条件选择 1 90～ 35 0 nm 波长对 PCF溶液 (0 . 2g·L- 1)进行紫外光吸收扫描 ,狭缝宽度 :5 nm;扫描速度 :2 0 0 nm· min- 1。1 .2 .3统计处理 全部数据均以 x± s表示 ,各组间比较采用方差分析 (F检验 )。2 结果2 .1 PCF对淋巴细胞的保护作用由表 2所示 ,在脾淋巴细胞和胸腺淋巴细胞悬液中加入 DEX后 ,其吸收度值 (A)明显降低 ,与对照组比较有极显著性差异 (P<0 .0 1 )。而加入 DEX和 PCF后 ,其吸收度值明显增高 ,与对照组和 DEX组比较均有极显著性差异 (P<0 .0 1 )。Table2 The protective action of PCF on lymphocytegroup Absobance value( x±s,n=3)spleen thymuscontrol groupDEX groupDEX+PCF group0 . 397± 0 . 0 2 00 . 2 18± 0 . 0 12 * *0 . 4 64± 0 . 0 13* *△△0 . 171± 0 . 0 130 . 119± 0 . 0 0 3* *0 . 568± 0 . 0 10 * *△△* * P<0 .0 1,vs control group△△P<0 . 0 1,vs control and DEX group2 .2 PCF的反相液相色谱在进行反相液相色谱之前 ,选择 1 90～35 0 nm波长对 PCF进行紫外吸收光谱扫描 ,发现在 2 70 nm波长处有一最大吸收峰。进一步用RPL C对 PCF进行梯度洗脱 ,得到保留时间为1 :3.92 3;2 :4.86 5 ;3:5 .0 33;4:5 .44 1的4个峰 (见图 1 )。Retention time ( t· min-1)Fig. 1 Chromatogram of PCF3 讨论本实验利用 MTT法检测细胞的存活和生长。MTT是一种能接受氢原子的染料 ,活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中 ,而死细胞并无此功能。 DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物 ,用酶联免疫检测仪在 490 nm波长处测定其吸收度 ,可间接反映活细胞的数量和活性 ,它的特点是灵敏度高 ,重复性好 ,操作简便、快速 ,并与其它检测细胞活力的方法有良好的相关性。有研究报道 ,糖皮质激素 (glucocorticoidhormones,GCH)是一种免疫抑制剂 ,能引起免疫器官萎缩和免疫机能的抑制 ,对胸腺未成熟淋巴细胞的分化起着重要的选择作用 <5> 。DEX等糖皮质类固醇药物具与 GCH相似的作用 <6> 。我们采用 MTT比色检测法检测 PCF对免疫细胞的影响 ,用 DEX与脾脏和胸腺淋巴细胞共同培养 ,发现其对淋巴细胞的活性有明显的抑制作用 ,建立了淋巴细胞免疫抑制病理模型。胸腺是中枢淋巴细胞器官 ,是培育 T淋巴细胞的场所 ;而脾脏为周围淋巴细胞 ,T、 B淋巴细胞受到抗原刺激后产生免疫反应的场所 ,因此 ,PCF对免疫细胞的刺激作用是广泛的。同时发现 PCF能明显地减弱 DEX对淋巴细胞的抑制作用 ,从而对淋巴细胞的活性具有促进作用。为了进一步了解 PCF的功能组分 ,在 PCF反相液相色谱中 ,我们采用梯度洗脱技术分离 PCF,目的是为了缩短分离时间 ,提高分离度 ,改善峰形 ,使微量组分容易被检出 ,而提高检测的灵敏度。由分析结果可见 ,测定紫外光谱可在 2 70 nm波长处得到 1个吸收峰 ,进一步用反相液相色谱可分离得到 4个峰 ,且分离良好 ,说明 PCF中尚存在着 4个组分。众所周知 ,HPL C具有分离效能好 ,分析速度快 ,灵敏度高 ,流出组分容易收集等特点 <7> 除了用其鉴定化合物外 ,尚可分离蛋白质和多肽 <8>。由前所述 ,扇贝多肽具有抗皮肤老化的作用。但在相对分子质量为 80 0～ 1 0 0 0 D的海洋肽中 ,其四个组分中究竟哪一种具有抗皮肤老化作用 ,或其抗皮肤老化作用最强 ?因此 ,可利用 RPL C,经过半制备的方法 ,得到单一组分来进一步研究。扇贝多肽对淋巴细胞的保护作用和反相液相色谱分析@杜卫$青岛大学医学院!青岛266021
@刘晓萍$青岛大学医学院!青岛266021
@梁惠$青岛大学医学院!青岛266021
@王玉贞$青岛大学医学院!青岛266021
@王春波$青岛大学医学院!青岛266021多肽;;淋巴细胞;;免疫作用;;反相液相色谱为进一步研究扇贝多肽 (海洋肽 ,PCF)对淋巴细胞的作用及其成分。采用地塞米松 ( DEX)与脾脏和胸腺淋巴细胞共同培养 ,建立了淋巴细胞免疫抑制实验模型。并利用反相液相色谱法 ( RPLC)对 PCF进行了分析。结果表明 ,DEX能显著降低脾脏和胸腺淋巴细胞的活性 ,DEX组吸收度值明显降低 ( P<0 .0 1) ;而 PCF不仅能显著地减轻其对免疫细胞的抑制作用 ,同时还可以促进免疫细胞的活性 ,使 DEX+PCF组吸收度值明显增高( P<0 .0 1)。相对分子质量为 80 0～ 10 0 0 D的 PCF经 RPL C分析含有保留时间为 3.92 3,4 .865,5.0 33,5.4 4 1等4个组分。实验证明 ,PCF对 DEX引起的淋巴细胞抑制具有保护作用。1 Pryor WA.Free radicalsin biology.New York:AcademicPress,1980 :95
2 王春波 ,何孟泉 ,秦守哲 ,等 .海洋肽的体外抗氧化作用.中国海洋药物杂志 ,1998,17(3) :15
3 王春波 ,何孟泉 ,秦守哲 ,等 .海洋肽抗皮肤老化作用的实验研究 .中华医学美容杂志 ,1998,4(4 ) :9
4 司徒镇强 ,吴军正主编 .细胞培育 .西安世界图书出版社 ,西安 ,1999,196
5 Rocha B,Von Boehmer H,Peripheral selection of the T-ceel repertoire.Science,1991,2 5 1:12 2 5
6 朱镇宇 ,潘景 ,赵群 ,等 .地塞米松诱导裸鼠脾细胞程序性死亡的研究 .中国病理生理杂志 ,1996 ,12 (2 ) :113
7 孙毓庆 .现代色谱
More abstracts about the 扇贝多肽对淋巴细胞的保护作用和反相液相色谱分析