药理、生化和神经解剖学研究表明，阿片受体至少有４种亚型（μ，δ，κ１和κ３）。由于阿片受 体的多样性，造成阿片耐受和依赖机制极为复杂。目前多选择主要含有某一特异亚型阿片受体的细 胞株，进行阿片受体信号传导通路的研究。研究表明，这些细胞株都通过其阿片受体Ｇｉ／Ｇｏ蛋 白耦联负调控腺苷酸环化酶（ａｄｅｎｙｌｙｌｃｙｃｌａｓｅ，ＡＣ）活性［１，２］。Ｅｖａ ｎｓ和Ｋｉｅｆｅｒ从ＮＧ１０８１５细胞中首次克隆出δ受体的ｃＤＮＡ［３，４］。虽然 ＮＧ１０８１５细胞富含δ受体，但表达ｉＮＯＳ的基础活性很低。为了深入研究ｉＮＯＳ基 因功能表达在δ阿片受体耐受和依赖机制中的调控作用，以期寻找新的治疗药物，我们选用该细 胞株为靶细胞，进行ｉＮＯＳ基因转移，建立ｉＮＯＳ稳定表达的ＮＧＬＮＣＸｉＮＯＳ细胞株 ，其重组酶具有天然ｉＮＯＳ的生化和药理特性［５，６］。为了验证这种转基因细胞是否可做为 阿片耐受和依赖中依赖的细胞模型，本文探讨了阿片类药物对ＮＧＬＮＣＸｉＮＯＳ细胞δ阿 片受体介导的ＡＣｃＡＭＰ信号系统影响。材料与方法药品与试剂盐酸吗啡和盐酸埃托啡（ｅｔ ｏｒｐｈｉｎｅ，Ｅｔｏｒ）由中国军事医学科学院提供；高选择性收稿日期：１９９８０９ ２９基金项目：国家自然科学基金资助项目（３９６７０８２７）联系人Ｔｅｌ：（０１０） ６５２９６４０３，Ｆａｘ：（０１０）６５２４０５２９，Ｅｍａｉｌ：ｊｓｌｉｕ＠ｐｕｂ ｌｉｃ．ｂｔａ．ｎｅｔ．ｃｎ臧梦维女，３５岁，副教授，博士生刘景生男，６２岁，教授，博 士生导师δ阿片激动剂ＤＰＤＰＥ（ＤＰｅｎ２，ＤＰｅｎ５ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ，Ｔ ｙｒＤＰｅｎＧｌｙＰｈｅＤＰｅｎＯＨ，Ｐｅｎ＝ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎ ｅ），ＤＡＤＬＥ（ＤＡｌａ２，ＤＬｅｕ５ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ），盐酸纳洛酮和百日 咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｉｓｔｏｘｉｎ，ＰＴＸ），ＡＣ激动剂ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｆｏｒｓ） ，磷酸二酯酶（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ，ＰＤＥ）抑制剂ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅ ｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ），ｃＡＭＰ标准品购于Ｓｉｇｍａ公司；３ＨｃＡＭ Ｐ（比活度１０×１０１２Ｂｑ·ｍｍｏｌ－１）和３ＨＥｔｏｒ（比活度１１×１０１２ Ｂｑ·ｍｍｏｌ－１）为中国科学院原子能研究所生产；高糖ＤＭＥＭ培养基和Ｇ４１８（ｇｅｎ ｅｔｉｃｉｎ）为Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ公司产品。细胞培养携有ｉＮＯＳ，ｃＤＮＡ和Ｎｅｏ抗性 基因的重组逆转录病毒载体转染神经母细胞瘤来源的ＮＧ１０８１５细胞，建立了ＮＧＬＮＣ ＸｉＮＯＳ细胞株［６］。ＮＧＮｅｏ细胞株是带有Ｎｅｏ抗性基因的空载体转染后形成的Ｇ４ １８抗性克隆。上述二个细胞株生长于含有Ｇ４１８２００μｇ·ｍＬ－１、青霉素１００ｕ·ｍ Ｌ－１、链霉素１００μｇ·ｍＬ－１、谷氨酰胺２×１０－３ｍｏｌ·Ｌ－１、次黄嘌呤１０ ×１０－４ｍｏｌ·Ｌ－１、胸腺嘧啶１６×１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１、氨基喋呤４０×１０ －７ｍｏｌ·Ｌ－１和１０％新生牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养基中；而ＮＧ１０８１５细胞在不 含Ｇ４１８的完全培养基中传代。ｃＡＭＰ含量测定参照Ｍａｌａｔｙｎｓｋａ等［７］方法制备 样本，以２×１０５细胞／孔接种于１２孔培养板，待细胞贴壁，加药预处理或直接测定。在加入 或不加入纳洛酮情况下，加入ＫｒｅｂｓＲｉｎｇｅｒＨＥＰＥＳ缓冲液（ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ：ＮａＣｌ１００，ＫＣｌ５，ＭｇＣｌ２１，ＣａＣｌ２１８，葡萄糖２５，蔗糖５５，ＨＥ ＰＥＳ１０，ｐＨ７４）即ＫＲＨＢ０５ｍＬ，内含Ｆｏｒｓ１０μｍｏｌ·Ｌ－１，ＩＢＭ Ｘ０２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１和各种阿片类药物，３７℃温育１５ｍｉｎ，再加入预冷ＴＥ缓冲液 （Ｔｒｉｓ·Ｃｌ５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ＥＤＴＡ４ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ｐＨ７５）终止反应 ，将孔底细胞刮下，１００℃水浴５ｍｉｎ，４℃１２０００×ｇ离心５ｍｉｎ，取上清液测定ｃ ＡＭＰ含量和蛋白含量。按照刘景生等（１９８１）报道的竞争性结合蛋白法测定胞内ｃＡＭＰ含 量。放射受体结合实验参考文献报道［７，８］完整细胞受体结合实验方法，加以改良。（３～５ ）×１０５细胞／孔接种于１２孔板，加药预处理或直接测定饱和曲线。用ＫＲＨＢ洗涤细胞，总 结合管中加入不同浓度３ＨＥｔｏｒ，非特异性结合管除３ＨＥｔｏｒ外，另加入Ｅｔｏｒ２ ０μｍｏｌ，反应总体积１ｍＬ。置于３７℃保温４０ｍｉｎ，加冰预冷５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｔ ｒｉｓ·Ｃｌ缓冲液（ｐＨ７５）２ｍＬ终止反应。将样品加至预先用００４％聚乙二醇包被 的玻璃纤维滤膜，减压抽滤，用Ｔｒｉｓ·Ｃｌ缓冲液洗膜，测定滤膜上的放射性强度。另取一块 接种相同密度细胞的培养板，每孔加入０５ｍｏｌ·Ｌ－１甲酸０５ｍＬ，４℃过夜，再用０ ５ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ０５ｍＬ溶解蛋白，测定蛋白含量。用每毫克蛋白结合的３ＨＥ ｔｏｒｆｍｏｌ数（ｆｍｏｌ·ｍｇ－１）来表示结果，以特异性结合为纵坐标，配体浓度为横坐 标，计算机进行非线性拟合，绘制饱和曲线。通过Ｓｃａｔｃｈａｒｄ作图，求平衡解离常数（Ｋ Ｄ）和受体最大结合容量（Ｂｍａｘ）。统计学处理数据以ｘ±ｓ表示，采用方差分析，差别如有 显著性，组间两两比较采用ｔ检验，以Ｐ＜００５作为显著性意义的界限。采用Ｌｏｇｉｔ法， 将药物作用的量效曲线转换成直线，求半数抑制量（ＩＣ５０）。结果１阿片类药物调节ＡＣ活性 的时效关系ＮＧ１０８１５细胞、ＮＧＮｅｏ细胞和ＮＧＬＮＣＸｉＮＯＳ细胞ｃＡＭＰ基 础水平较低。若在体外培养细胞中加入Ｆｏｒｓ和ＩＢＭＸ，３７℃温育１５ｍｉｎ，上述细胞株 ｃＡＭＰ含量分别比空白对照升高了５～１２倍（Ｐ＜００１）。选用δ阿片受体激动剂ＤＰ ＤＰＥ（１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１）预处理细胞不同时间后，再加入１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１ＤＰ ＤＰＥ做为ＤＰＤＰＥ组或加入１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１纳洛酮做为ＤＰＤＰＥ＋纳洛酮组的二种 情况下，置于３７℃孵育１５ｍｉｎ，观察ｃＡＭＰ变化的时间曲线。结果表明，１０－５ｍｏｌ ·Ｌ－１纳洛酮（纳洛酮对照）对Ｆｏｒｓ刺激ＡＣ活性，与Ｆｏｒｓ对照相比无明显变化（Ｐ＞ ００５）。ＤＰＤＰＥ作用细胞０２５ｈ和１ｈ，其胞内ｃＡＭＰ含量明显低于Ｆｏｒｓ对照 （Ｐ＜００５或Ｐ＜００１），而ＤＰＤＰＥ＋纳洛酮组ｃＡＭＰ含量高于ＤＰＤＰＥ组，可 见纳洛酮能对抗ＤＰＤＰＥ的短时程抑制效应。当ＤＰＤＰＥ持续作用２４ｈ，ＤＰＤＰＥ组和Ｄ ＰＤＰＥ＋纳洛酮组胞内ｃＡＭＰ含量逐渐上升，明显高于药物作用０２５ｈ（Ｐ＜００５） ，并维持４８ｈ（图１）。药物预处理０２５，１，６，１２，２４和４８ｈ，ＤＰＤＰＥ组胞 内ｃＡＭＰ含量分别是Ｆｏｒｓ对照的３４３％，４５０％，８５７％，９３８％和１０ ２６％，而ＤＰＤＰＥ＋纳洛酮组分别为７９９％，８３０％，９０８％，９１０％， １２４０％和１２００％，提示ＤＰＤＰＥ长时程作用对Ｆｏｒｓ刺激ｃＡＭＰ生成的抑制作 用减弱，胞内ｃＡＭＰ含量呈时间依赖性升高。加入纳洛酮诱发戒断时，胞内ｃＡＭＰ含量甚至超 过ＤＰＤＰＥ组，表现为反跳性升高。进一步比较了ＤＰＤＰＥ引起ＮＧ１０８１５细胞、转空 载ＮＧＮｅｏ细胞和ＮＧＬＮＣＸｉＮＯＳ细胞ｃＡＭＰ含量变化的时效曲线。结果表明，１ ０－６ｍｏｌ·Ｌ－１ＤＰＤＰＥ短时程作用３种细胞株，对Ｆｏｒｓ刺激ｃＡＭＰ增加的最大抑 制率（Ｉｍａｘ）分别为６６９％，５９８％和６９６％，三者之间无显著性差异（Ｐ＞０ ０５），随后胞内ｃＡＭＰ含量逐渐恢复，于药物作用２４ｈ趋于或达到Ｆｏｒｓ对照水平（Ｐ ＜００５）（图２）。说明ＤＰＤＰＥ预处理细胞２４～４８ｈ，胞内ｃＡＭＰ含量均呈代偿性 增高，对δ阿片激动剂的敏感性降低，不同细胞株的变化趋势基本一致。上述结果显示，ＤＰＤ ＰＥ刺激细胞１５ｍｉｎ，其抑制作用最明显，而持续作用４８ｈ，引起阿片受体脱敏和耐受，故 选用１５ｍｉｎ和４８ｈ分别作为药物短时程和长时程量效曲线观察的时间点。２阿片类药物短时 程作用对胞内ｃＡＭＰ水平的调节作用２．１阿片类药物短时程作用抑制ＡＣ活性的量效关系用ｉ ＮＯＳ转基因细胞的研究表明，当ＤＰＤＰＥ，ＤＡＤＬＥ和Ｅｔｏｒ剂量为１０－１０～１０－ ６ｍｏｌ·Ｌ－１，吗啡剂量为１０－９～１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１时，Ｆｏｒｓ刺激ｃＡＭＰ含 量呈剂量依赖性降低，ＩＣ５０分别为２０×１０－８，２１×１０－８，３７×１０－８ 和１７×１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１，其中ＤＰＤＰＥ抑制作用最强（图３）。Ｆｉｇ１Ｅｆｅｃ ｔｓｏｆｏｐｉｏｉｄａｇｏｎｉｓｔｏｒａｎｔａｇｏｎｉｓｔａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｎｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｆｏｒｓｋｏｌｉｎｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｃＡＭＰａｃｕｍｕ ｌａｔｉｏｎａｆｔｅｒＮＧＬＮＣＸｉＮＯＳｃｅｌｓｗｅｒｅｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔ ｈＤＰＤＰＥ（ＤＰｅｎ２，ＤＰｅｎ５ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）ｆｏｒｖａｒｉｏｕｓｔ ｉｍｅｓ．Ｔｈｅｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ×ｇｌｉｏｍａＮＧ１０８１５ｈｙｂｒｉｄｃ ｅｌｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔ ａｉｎｉｎｇｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｎｙｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ）ｇｅｎ ｅａｎｄＮＧＬＮＣＸｉＮＯＳｃｅｌｌｉｎｅｗｉｔｈｔｈｅｓｔａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｉｏｎｏｆｉＮＯＳａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ＮＧＬＮＣＸｉＮＯＳｃｅｌｓ，ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎ１２ｗｅｌｐｌａｔｅｓ，ｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅδｏｐｉｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒａｇｏｎｉｓｔＤＰＤＰＥ（１０－６
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