甲硝唑片的大肠杆菌检验方法探讨

甲硝唑（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）系抗阿米巴、抗滴虫、抗厌氧菌等类药。用于治疗滴虫病及 厌氧菌感染。特别是治疗厌氧菌感染有较强抗菌活性，已被世界卫生组织（ＷＨＯ）遴选为治疗厌 氧菌感染的基本药物。在甲硝唑片的微生物限度检查中，发现本品对控制菌（大肠杆菌）有抗菌作 用。按文献［１］规定的常规法对本品作了多次阳性对照试验，结果加入规定量的大肠杆菌均未检 出。证实了本品对大肠杆菌确有抗菌作用，同时也说明常规法不易检出大肠杆菌。关于本品大肠杆 菌的检验方法，目前尚未见报道。为了寻找适宜的大肠杆菌检验方法，根据甲硝唑的抗菌作用及微 溶于水的特性，作了不同方法的对比试验和阳性菌回收率试验。筛选出自然沉降法加稀释法，两法 联合应用是甲硝唑片较为适宜的大肠杆菌检验方法。１　试验材料１１　药品　甲硝唑片，本省 新乡征程制药厂、河南精忠制药厂、豫粤制药厂提供，试验用样品均不含菌，所用药品批号见表１ 、表２。１２　菌种　大肠杆菌（ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２）由中国药品生物制品检定所提供 。１３　培养基　胆盐乳糖增菌液（ＢＬ）、曙红亚甲蓝琼脂培养基（ＥＭＢ）按１９９５年版 《中国药典》二部附录ＸＩＪ微生物限度检查法配制。１４　稀释剂　０９％无菌生理盐水。 ２　试验方法２１　对照用菌液　取大肠杆菌的营养琼脂斜面新鲜培养物１白金耳，接种至营养 肉汤培养基内，培养２０ｈ后，稀释至１∶１０６。２２　供试液的制备　取本品１０ｇ加无菌 生理盐水１００ｍｌ，研磨，混匀，加入备妥的对照菌液，加菌量应控制每１０ｍｌ供试液含菌约 ５０～１００个。２３　增菌培养　取２２供试液１０ｍｌ，接种于１００ｍｌＢＬ增菌液中 ，为常规法；取２２供试液１０ｍｌ，接种于２００ｍｌＢＬ增菌液中为稀释法；取２２供试 液经自然沉降５ｍｉｎ，取上层液１０ｍｌ接种于１００ｍｌＢＬ增菌液中为沉降法；另取上层液 １０ｍｌ接种于２００ｍｌＢＬ增菌液中为沉降法＋稀释法。将上述各种体积的增菌液同置３６± １℃培养４８ｈ。２４　分离培养　分别取上述增菌培养液１～３环划线接种于ＥＭＢ琼脂平板 上，置３６±１℃培养４８ｈ，试验结果见表１。表１　大肠菌检出试验结果批号加菌量常规法１ ００ｍｌ稀释法２００ｍｌ沉降法１００ｍｌ沉降法±稀释法２００ｍｌ９５０１０１１００－－ －＋９５０２０１９５－－－＋９５０１０２９７－－＋＋９５０８１５９０－－－＋９５０８１ ６８８－－－＋９５０８１７８５－－＋＋９５０８０７７１－－－＋９５０８０９７０－－－＋ ９６０７０４６７－－－＋９６０１０７６８－－－＋　　－为无菌生长　＋为有菌生长３　细菌 回收率试验３１　供试液制备　同２２（加菌量应控制在每１ｍｌ供试液约１００个）。３ ２　细菌培养计数　取３１供试液经自然沉降５ｍｉｎ的上层液各１ｍｌ，分别加入２～３个平 皿（下称沉降法），倾注４５℃培养肉汤琼脂培养基置３０～３５℃培养４８ｈ，进行计数，取平 均值乘稀释倍数即为报告数，试验结果见表２。另取自然沉降５ｍｉｎ上层液１ｍｌ注入５个平皿 （每皿０２ｍｌ），作３份，共１５个平皿（下称沉降法＋稀释法）。将上述平皿中倾注４５℃ 营养肉汤琼脂培养基置３０～３５℃培养４８ｈ，进行细菌计数，将５个平皿的菌落计数合并为１ ｍｌ菌落数，共得３组数据，取３组数据平均值乘稀释倍数，即为报告数。结果见表２。表２　细 菌回收率试验结果批号样品含菌量加菌量个／ｍｌ沉降法测菌量细菌回收率％沉降法＋稀释法测定 量细菌回收率％９５０１０１０１００００８６８６００９５０２０１０９５００７４７７８ ９９５０１０２０９７３０３０９２７９８１４４９５０８１５０９０００６２６８８８９ ５０８１６０８８００６０６８１８９５０８１７０８５２０２２９４５８６８２４９５０ ８０７０７１００４８６７６１９５０８０９０７０００４７６７１４９６０７０４０６７０ ０４４６５６７９６０１０７０６８００４５６６１８均值７１７２４　试验结果分析４ １　从表１试验结果可以看出：取供试液的混悬液接种于１００ｍｌ和２００ｍｌＢＬ增菌液阳性 菌均未检出，取供试液自然沉降５ｍｉｎ的上层液接种于１００ｍｌＢＬ增菌液有２０％的阳性菌 检出，而取供试液自然沉降５ｍｉｎ的上层液接种于２００ｍｌＢＬ增菌液，均能检出接种的阳性 菌，检出率为１００％。４２　从表２试验结果可以看出：取供试液经沉降５ｍｉｎ的上层液做 细菌回收率的试验，细菌的回收率很低，而取供试液经沉降５ｍｉｎ的上层液做培养基稀释法细菌 回收率试验，回收率为７１７２％。４３　从以上结果笔者认为：自然沉降法加稀释法二法联 合应用是甲硝唑片适宜的大肠杆菌检验方法。细菌回收率不甚高的影响因素可能是：①由于生物试 验受各方面因素的影响较多。②因样品本身有抑菌作用，沉降以后未能完全排除。③样品沉降以后 细菌随着药渣沉降一部分，故导致细菌回收率不甚高。注：试验用样品均不含菌。甲硝唑片的大肠 杆菌检验方法探讨@任风兰$河南省药品检验所!郑州450003@马宏伟$河南省药品检验所 !郑州450003@丁惠清$河南省太康县血栓病医院甲硝唑;;沉降法;;稀释法;;大肠杆 菌目的：探讨甲硝唑片中大肠杆菌适宜的检验方法。方法：比较常规法、自然沉降法和自然沉降法加稀释法联用检验甲硝唑片中的大肠杆菌。结果：常规法和自然沉降法不易检出大肠杆菌。结论：自然沉降法加稀释法联用为该品种适宜的大肠杆菌检验方法1中华人民共和国卫生部药典委员会编《中国药典》1995 年版二部化学工业出版社,1995:53 ,附录:82
2 中国药品生物制品检定所编《药品卫生检验方法》1990 年版中华人民共和国卫生部,1990 :7甚高。注：试验用样品均不含菌。甲硝唑片的大肠杆菌检验方法探讨@任风兰$河南省药品检验 所!郑州450003@马宏伟$河南省药品检验所!郑州450003@丁惠清$河南省太康县 血栓病医院甲硝唑;;沉降法;;稀释法;;大肠杆菌目的：探讨甲硝唑片中大肠杆菌适宜的检验 方法。方法：比较常规法、自然沉降法和自然沉降法加稀释法联用检验甲硝唑片中的大肠杆菌。结 果：常规法和自然沉降法不易检出大肠杆菌。结论：自然沉降法加稀释法联用为该品种适宜的大肠杆菌检验方法1中华人民共和国卫生部药典委员会编《中国药典》1995 年版二部化学工业出版社,1995:53 ,附录:82
2 中国药品生物制品检定所编《药品卫生检验方法》1990 年版中华人民共和国卫生部,1990 :7