o引言近三十年来，国内外科学家愈来愈注重对银杏叶的研究，逐渐发现银杏叶具有独特的生理作用 和治疗价值。特别是发现银杏叶提取物能有效地治疗老年性痴呆、脑损伤后遗症和心血管疾病等症 状［‘一到后，使银杏叶成为近代植物药物开发研究的热点之一，从而有力地推动银杏叶提取物化 学成分及其药理作用的研究。现已知道。银杏叶提取物主要包括两类重要生理活性物质：菌类内酯 和黄酮类化合物［3－5］。本文以化学发光法和分光光度法研究了水溶性和酸溶性银杏叶黄酮抗 氧化作用。互材料与方法1．1材料1．1．1银杏（GinkgobilobaL．）叶（来自 浙江，秋季）黄酮W为水溶性的冷冻干燥品（简称黄酮W），银杏叶黄酮H为醇溶性的冷冻干燥品 （简称黄酮H）（两者均由上海医科大学药学院提供）。1．1．2试剂黄源哈、黄源哈氧化酶、 鲁米诺购自Signa公司；流代巴比妥酸（TB）系国产化学试剂；抗坏血酸、硫酸铜、硫酸亚 铁、过氧化氢、三氯乙酸（TCA）及其它试剂均系国产分析纯；调理酵母多糖由本皇制备。试剂 配制使用高纯度的去离子水。1．1．3仪器SHG－1型生物化学发光测量仪（由上海技术监督 局工厂制造）；721分光光度计（上海第三分析仪器厂制造）。1．2试验方法1．2．1产生 Oi的化学发光体系按文献肝］报道，采用黄源哈一黄q吟氧化酶一鲁米诺产生Oi的发光体系。 1．2．2产生o的化学发光体系按文献卜做道，采用抗坏血酸一CUSO4一酵母一HZOZ产 生OH’的发光体系。1．2．3化学发光法测HZOZ的消除采用OH－－HZOZ一香米诺的 化学发光体系：不同浓度的黄酮W和H各IO0pl，加入30（）p磷酸缓冲液（pH8．0） ，再放入发光仪中，原位注入500pl4X10－‘mol／L鲁米诺溶液启动化学发光反应， 测量10秒钟的积分发光强度（CP10S）。以无黄酮W和H管的积分发光强度为参比，分别计 算出黄酮W和H对化学发光体系的发光抑制率。l．2．4全血嗜中性白细胞的化学发光（PMN －CL）按文献［幻的方法稍加修改。PMN在加入调理的酵母多糖以后，因吞噬酵母多糖而产生 “呼吸爆发”，出现大量的活性氧，活性氧使鲁米诺受激发光。豆．2．5Fe”2诱发脂蛋白P UFA过氧化体系按文献【列报道，以Fe”2诱发卵黄磷脂C－2位上的极低密度脂蛋白（VL DL）和低密度脂蛋白（LDL）过不饱和脂肪酸（PUFA）的过氧化比色体系，来评价黄酮W 和H的抗氧化活性（AOA）。黄酮W和H的AOA用对卵黄脂蛋白LPO的抑制率（％）表示。 AOA（％）2《对照管As。值一样品管A532）为对照管AS。。值）X100％1．2． 6在上述各体系中，直接用各体系缓冲液溶解黄酮W，其对照也加等量的缓冲液，称为对照1；对 于黄酮H，则先用微量乙醇溶解，再用大量缓冲液稀释至所需浓度，其对照也加等量缓冲液（内含 相等微量乙醇），称为对照2。2结果与讨论21对o的清除作用黄酮W和H程度不同地抑制Oi 体系的化学发光作用，在10～100pg／ml范围内，随着黄酮W和H浓度的增加，发光强度 随之下降，以发光抑制率50％（IC50）为指标，黄酮W和H的IC5o分别为14Pg／m l和48ng／ml，其中以黄酮W清除Oi作用为佳（如表1所示）。2．2对OH”的清除作 用利用抗坏血酸一CZ”2一酵母一HZOZ产生OH“化学发光体系间接证明了黄酮W和H无清 除OH“作用（数据略）。2．3对HZOZ的抑制作用黄国W和H都能显著抑制OH－H202 一鲁米诺化学发光体系的发光，减弱的程度也以IC5o表示，则黄酮W和H的ICso分别为5 ．opg／ml和13pg／ml，也是黄酮W为佳，结果见表人这说明黄酮W和H都具有清除H ZOZ的作用，至少能竞争性地夺取H202能量，或者两者作用兼而有之。2．4对全血吞噬细 胞发光的影响在血清调理的酵母多糖刺激下，血中嗜中性白细胞（PMN）被激活，出现“呼吸爆 发”产生‘Q、HZOZ、O3、OH”等活性氧，这些活性氧的能量传递给体系中的鲁米诺，使 其激发发光。如果清除了活性氧，就可明显地降低化学发光强度。试验表明，黄酮W和H都能明显 地抑制PMN－CL，并呈剂量依赖关系（见表3），这说明黄酮W和H都具有清除多种活性氧的 作用。若以发光峰值作指标，黄酮W和H的IC50分别为Zlpg／inl和gpg／thl， 黄酮H优于黄酮W（见图1）。由于黄酮W清除oi和H202能力优于黄酮H，所以提示黄酮H 清肾Q等活性氧的作用有可能远远大于黄酮W。2．5对脂质过氧化的防护作用卵黄中磷脂C－2 位上所含VLDL和LDL中的PUFA在Fe”’的催化下，经振荡，能诱发过氧化，产生烷氧 基（L”）和烷过氧基（LO“），再引发链式和链式支链反应。在加热的条件下，过氧化产物可 与TBA反应产生红色化合物，并在532urn波长处有显著光吸收。试验表明，黄酮W和H的 50％AOA浓度分别为Z10pg／ml和45pg／ml（见表4）。黄酮H显著优于黄酮W ，提示黄酮H清除LO’和L00“能力明显强于黄酮W。上述试验表明，银杏叶黄酮W和H都具 有较强的清除活性氧和自由基的作用，是一种功能较多的抗氧化剂。然而，两者清除活性氧的能力 差异显著。许多研究已表明，机体内活性氧、自由基过是会引起脂质过氧化、蛋白质变性、酶失活 、多糖降解对NA链断裂、生物结构受损、细胞解体乃至机体病变和死亡。因此，清除过量活性氧 、自由基，其生理意义重大。而银叶黄酮W和H都能有效的清除多种活性氧、自由基，有效地抑制 脂质过氧化，这就提示银杏叶黄酮W和H有可能会程度不同地减轻上述某些危害。据研究，银杏叶 中含有几十种黄酮类化合物，有双黄酮、黄酮音和黄酮吉元等［‘－5］，这些黄酮类化合物大多 具有酚羟基，这些酚羟基往往是清除自由基、活性氧的活性基团［‘0］。但是银杏叶中哪种黄酮 清除哪类自由基、活性氧最有效还有待于深入研究。我国是银杏的主要产地之一，拥有银杏资源优 势，再加上拥有丰富的中医药经验，所以在银杏资源开发上会大有作为。银杏叶黄酮抗氧化作用的 研究@陈季武$华东师范大学生物系!上海200062@胡天喜$华东师范大学生物系!上海2 00062@朱振勤$华东师范大学生物系!上海200062银杏叶黄酮;;活性氧;;自由基 ;;抗氧化;;化学发光利用化学发光法和分光光度法研究了银杏叶黄酮W和H抗氧化作用。结果表明，水溶性的黄酮W和醇溶性的黄酮H不仅能有效地清除O-·2、H2O2，而且能抑制脂质过氧化，并提示两者都有可能清除LO、LOO和1O2。然而，两者清除这些活性氧能力差异显著，且都无清除OH能力。<1>Kleijnen J,Knipschild P. Ginkgo biloba. Lancet, 1992,340: 1136
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