手性ＨＰＬＣ法测定布洛芬立体选择性酯化的转化率和对映体过量⒇谢渝春刘会洲陈家镛（中国科学 院化工冶金研究所分离科学与工程青年实验室北京１０００８０）提要以脂肪酶在正己烷中催化消 旋布洛芬与正丁醇的立体选择性酯化反应为例，研究了用手性ＨＰＬＣ法进行分析时产物及底物的 峰面积变化与转化率的关系，确定了布洛芬丁酯与未反应布洛芬的峰面积－浓度响应因子的比值， 从而可通过一次进样用峰面积直接测定布洛芬的转化率和对映体过量。关键词手性高效液相色谱法 ，布洛芬，转化率，对映体过量分类号Ｏ６５８／Ｒ９１前言α－芳基丙酸是重要的非甾体抗炎药 ，在α－碳原子上有一个不对称的手性中心，这类药物的活性主要来自（＋）－Ｓ－对映体［１］ 。布洛芬［（Ｒ，Ｓ）－２－（４－异丁基苯基）－丙酸］是其中重要的一种，目前仍以消旋体的 形式出售。在研究制备Ｓ－布洛芬方面，除用不对称合成［２］等方法外，脂肪酶催化的消旋布洛 芬酯的水解［３］和在有机溶剂中布洛芬与醇的酯化［４］等立体选择性过程近来也受到高度重视 。在对拆分过程进行条件优化特别是在进行动力学研究时，需要监测转化率和对映体过量随时间的 变化进程。手性ＨＰＬＣ法无疑是完成这类分析的有力手段，但大多通过（内标或外标）标准曲线 对反应物或产物进行定量。实际上，在检测器的线性范围内，结合质量守恒定律可以通过产物和底 物的峰面积归一化求出转化率。这时，唯一需要事先确定的是产物和底物的峰面积－浓度响应因子 的比值，文献［５］就用这种“自归一化法”测定了萘普生对映体的转化率。鉴于此法的快捷性和 准确性，我们以皱落假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）脂肪酶在正己烷中催化消旋布洛芬 与正丁醇的酯化反应为例，在Ｒｅｇｉｓ（Ｓ，Ｓ）Ｗｈｅｌｋ－０１柱［６］上研究了用这种方 法分析布洛芬的拆分过程。２自归一化法原理在紫外检测器的线性范围内，峰面积Ａ与各组分的浓 度呈正比，而反应物和产物的总摩尔浓度在反应进程中是守恒的，因此转化率ｃ可表示为ｃ＝Ａｅ ／［Ａｅ＋（ｆｅ／ｆｉＲ）ＡｉＲ＋（ｆｅ／ｆｉＳ）ＡｉＳ）］（１）其中ｆ为峰面积－摩尔 浓度响应因子，下标ｉ，ｅ，Ｒ，Ｓ分别表示布洛芬、酯和不同对映体。由于在本实验条件下产物 酯的对映体分不开，所以两个酯对映体只有一个峰。这样，只要能够得到产物与底物的响应因子之 比，就可通过式（１）用峰面积直接计算转化率。３实验部分３．１仪器ＨＰ－１０９０高效液相 色谱仪，ＨＰ－Ａ．０４．０１色谱工作站。３．２色谱条件Ｒｅｇｉｓ（Ｓ，Ｓ）Ｗｈｅｌｋ－ ０１手性柱，流动相为正己烷－异丙醇－乙酸－三乙胺（１５∶８５∶０．２∶０．０５），流速 为０．４ｍＬ／ｍｉｎ，测定波长为ＵＶ２５４ｎｍ。３．３材料消旋布洛芬和皱落假丝酵母脂肪 酶（ｔｙｐｅⅦ，８３５Ｓｉｇｍａ活力单位／毫克固体，在１０３℃下用失重法测得含水量为６ ．９％）购自Ｓｉｇｍａ公司，色谱纯正己烷和异丙醇购自天津四友公司，色谱纯乙酸、分析纯丁 醇和三乙胺购自北京试剂公司。３．４消旋布洛芬的立体选择性酯化在数个１５ｍＬ小瓶中，分别 加入含布洛芬（５ｇ／Ｌ，２４ｍｍｏｌ／Ｌ）、正丁醇（５ｍＬ／Ｌ，５４．７ｍｍｏｌ／Ｌ） 的正己烷溶液５ｍＬ，在１～２０ｇ／Ｌ的酶浓度范围内加入不同量的脂肪酶后密封，放入４０℃ 恒温水浴摇床中反应，转速１５０ｒ／ｍｉｎ。经一定时间后得到不同转化率的样品，酶浓度大的 体系转化率相应较大。取５０μＬ样品在室温下将溶剂蒸干，然后用流动相定容至１ｍＬ进样分析 。用溶于流动相的已知浓度的消旋布洛芬作外标，测定反应液中未反应布洛芬对映体的浓度，根据 各对映体浓度的减少确定转化率和底物的对映体过量。４实验结果和讨论４．１布洛芬对映体及酯 的色谱分离图１消旋布洛芬对映体（ａ）、布洛芬对映体和布洛芬丁酯（ｂ）的色谱分离Ｆｉｇ． １Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆ（ａ）ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓｏｆｒａｃｅｍｉｃｉｂｕｐｒｏｆ ｅｎ，（ｂ）ｎ┐ｂｕｔｙｌｉｂｕｐｒｏｆｅｎｅｓｔｅｒａｎｄｔｈｅｕｎｒｅａｃｔｅｄｉ ｂｕｐｒｏｆｅｎｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ１．Ｒ－布洛芬，２．Ｓ－布洛芬，３．（Ｒ＋Ｓ）－ 布洛芬正丁酯。１．Ｒ－ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ，２．Ｓ－ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ，３．（Ｒ＋Ｓ）－ ｎ－ｂｕｔｙｌｉｂｕｐｒｏｆｅｎｅｓｔｅｒ．布洛芬对映体和布洛芬丁酯的分离如图１所示， 用对映体的分离度足以精确地测定对映体的纯度。布洛芬丁酯的对映体在本实验条件下分不开，用 色谱图上的峰面积通过式（１）只能直接计算总转化率ｃ，但在底物的对映体纯度ｅｅｉ已知的情 况下，酯的对映体纯度ｅｅ可以通过ｃ＝ｅｅｉ／（ｅｉ＋ｅｅｅ）计算。４．２消旋布洛芬外标 标准曲线图２消旋布洛芬作外标的布洛芬对映体标准曲线Ｆｉｇ．２Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕ ｒｖｅｏｆｉｂｕｐｒｏｆｅｎｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓｗｉｔｈｒａｃｅｍｉｃｉｂｕｐｒｏｆ ｅｎａｓｅｘｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄ１．Ｒ－对映体，２．Ｓ－对映体。１．Ｒ－ｉｓｏ ｍｅｒ，２．Ｓ－ｉｓｏｍｅｒ．图２是用消旋布洛芬作外标的各对映体峰面积（ｍＡｕ×ｓ）－ 浓度（ｇ／Ｌ）标准曲线，显然，两对映体的标准曲线是重合的，即ｆｉＲ＝ｆｉＳ＝ｆｉ，经回 归分析的相关系数分别为０．９９９８和０．９９９５。因此，在经过立体选择性酯化以后，未反 应底物的对映体过量ｅｅｉ可通过ＡｉＲ和ＡｉＳ直接计算：ｅｅｉ＝（ＡｉＲ－ＡｉＳ）／（Ａ ｉＲ＋ＡｉＳ）（２）４．３ｆｅ／ｆｉ的实验确定（两种方法）第一种方法，将式（１）写成如 下形式：ｃ－１－１＝（ｆｅ／ｆｉ）［（ＡｉＲ＋ＡｉＳ）／Ａｅ］（３）用外标法测定各样品 的转化率ｃ，再将（ＡｉＲ＋ＡｉＳ）／Ａｅ对（ｃ－１－１）作图，得到一条斜率为１的直线（ 如图３所示），由式（３）得ｆｅ／ｆｉ＝１。第二种方法，用和样品反应前浓度相同的消旋布洛 芬正己烷溶液与已知转化率为ｃ０（５１．７６％，外标法测定）的反应液按体积比ｍ／ｎ（１／ ２０，１／１０，１／５，１／２，１／１，２／１，５／１）混合，则混合后样品的转化率为ｃ ＝ｃ０／（１＋ｍ／ｎ），但该样品的转化率同样可根据其色谱图由式（１）计算，因此下式成立 ：ｃ－１０（１＋ｍ／ｎ）－１＝（ｆｅ／ｆｉ）［（ＡｉＲ＋ＡｉＳ）／Ａｅ］（４）图４是这 些混合样品的（ＡｉＲ＋ＡｉＳ）／Ａｅ随（１／ｃ０）（１＋ｍ／ｎ）－１的变化关系，也是一 条斜率为１的直线，由式（４）得ｆｅ／ｆｉ＝１。因此，布洛芬丁酯和布洛芬的峰面积－浓度响 应因子相等，即酯化反应引入的丁基不影响ＵＶ２５４ｎｍ的吸收，这个结果可望能够用于布洛芬 与其它烷基醇的酯化。上述反应液混合前底物的ｅｉ［由式（２）计算］为９０．４７％，与不同 体积比的消旋布洛芬混合（相当于加标）后各样品ｅｉ的计算值为［ｎ／（ｍ＋ｎ）］×９０．４ ７％，各混合样品进样后由式（２）测定的ｅｉ对其计算值的平均回收率为９９．８％，ＲＳＤ为 １．６％。图３未反应布洛芬和布洛芬丁酯的峰面积比（ＡｉＲ＋ＡｉＳ）／Ａｅ与（ｃ－１－１ ）的关系Ｆｉｇ．３Ｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｒｅａｒａｔｉｏｏｆｕｎｒｅａｃｔｅｄ ｉｂｕｐｒｏｆｅｎｔｏｉｂｕｐｒｏｆｅｎｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ（ＡｉＲ＋ＡｉＳ）／Ａｅａ ｇａｉｎｓｔ（ｃ－１－１）图４改变消旋布洛芬溶液与转化率为ｃ０的反应液混合体积比ｍ／ｎ 时（ＡｉＲ＋ＡｉＳ）／Ａｅ与［（１／ｃ０）（１＋ｍ／ｎ）－１］的关系Ｆｉｇ．４Ｖａｒｉ ａｔｉｏｎｏｆ（ＡｉＲ＋ＡｉＳ）／Ａｅａｇａｉｎｓｔ［（１／ｃ０）（１＋ｍ／ｎ）－１］ ａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖｏｌｕｍｅｒａｔｉｏｍ／ｎ参考文献１ＨｕｔＡＪ，Ｃａｌｄｗｅｌ Ｊ．ＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎ，１９８４，９：３７１－３７９２ＳｏｎａｗａｎｅＨＲ ，ＢｅｌｕｒＮＳ，ＡｈｕｊａＪＲｅｔａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅ－ｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ，１９９２，３：１６３－１９２３ＳｉｈＣＪ，ＧｕＱＭ，ＦｕｌｉｎｇＧ，ＷｕＳＨ，Ｒｅｄ ｄｙＤＲ．ＤｅｖＩｎｄＭｉｃｒｏｂ，１９８８，２９：２２１－２２９４ＡｒｒｏｙｏＭ，Ｓ ｉｎｉｓｔｅｒｒａＪＶ．ＪＯｒｇＣｈｅｍ，１９９４，５９：４４１０－４４１７５Ｔｓａｉ ＳＷ，ＷｅｉＨＪ．ＪＬｉｑＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ，１９９３，１６：２９９３－３００１６Ｐ ｉｒｋｌｅＷＨ，ＷｅｌｃｈＣＪ．ＪＬｉｑＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ，１９９２，１５：１９４７ －１９５５ＣｈｉｒａｌＨＰＬＣＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎａｎｄ ＥｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃＥｘｃｅｓｏｆＥｎｚｙｍｅＣａｔａｌｙｚｅｄＳｔｅｒｅｏｓｅｌ ｅｃｔｉｖｅＥｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲａｃｅｍｉｃＩｂｕｐｒｏｆｅｎＸｉｅＹｕ ｃｈｕｎ，ＬｉｕＨｕｉｚｈｏｕａｎｄＣｈｅｎＪｉａｙｏｎｇ（ＹｏｕｎｇＳｃｉｅｎｔｉｓ ｔＬａｂ．ｏｆＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｒｉｎｇ，Ｉｎｓｔｉｔｕ ｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＭｅｔａｌｕｒｇｙ，ｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃ ｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００８０）ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｅ ｎｚｙｍｅｃａｔａｌｙｚｅｄｋｉｎｅｔｉｃｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｒａｃｅｍａｔｅｓ， ｉｔｉｓｉｍｐｅｒａｔｉｖｅｔｏａｓｓａｙｈｏｗｔｈｅｏｐｔｉｃａｌｙｉｅｌｄｖａｒｉ ｅｓｗｉｔｈｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ａｍｅｔｈｏ ｄｕｓｉｎｇｏｎｅ－ｔｉｍｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃｅｘｃｅｓｓａｎｄｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒａｃｅｍｉｃｉｂｕｐｒｏｆｅｎｗｉｔｈｎ－ｂｕｔａｎｏｌｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｌｉｐａｓｅｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｗｉｔｈａｃｏｍｍｅｒｃｉ
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