β内啡肽对谷氨酸神经毒性作用的影响高静朱俐赵晓宁张祖暄（南京大学医学院，药理学教研室， 南京２１００９３）摘要采用形态学观察、β内啡肽（βＥｎｄ）放射免疫测定及单细胞内游 离钙浓度［Ｃａ２＋］ｉ检测等方法，观察了βＥｎｄ对谷氨酸单钠（ＭＳＧ）诱发神经元损伤 的影响，分析了可能的作用机制。结果表明，βＥｎｄ可以明显加重ＭＳＧ诱发的下丘脑弓状核 神经元的损伤；βＥｎｄ和ＭＳＧ诱发的［Ｃａ２＋］ｉ增高可被维拉帕米部分逆转。另外，吗 啡可以进一步加剧ＭＳＧ诱导的各脑区βＥｎｄ含量的变化。提示βＥｎｄ可以明显地加剧Ｍ ＳＧ的神经毒性作用，其机制与ＭＳＧ能诱发脑内βＥｎｄ的含量的增多及βＥｎｄ可进一步 破坏ＭＳＧ引起的胞内钙稳态失衡有关。关键词β内啡肽；谷氨酸单钠；神经毒性；钙；弓状核 近年的研究表明，兴奋性毒素（如谷氨酸单钠，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍｇｌｕｔａｍａｔｅ，ＭＳ Ｇ）的神经毒性与多种急慢性神经退化病的形成有关［１］，这种兴奋性毒性作用可以被单纯疱疹 病毒［２］，镧系元素Ｈｏ３＋［３］及吗啡［４］等增强。鉴于吗啡是一种外源性阿片样物质， 由此推测，内源性阿片样物质对兴奋性毒素也应有类似的作用。本文用形态学观察、放射免疫测定 和胞内游离钙测定等方法，观察了内源性阿片样物质β内啡肽（βｅｎｄｏｒｐｈｉｎ，β Ｅｎｄ）对ＭＳＧ神经毒性的影响，探讨了其可能的作用机制。材料和方法形态学观察和图像分析 ２４只新生小鼠（７～９日龄）随机分成生理盐水对照，ＭＳＧ（０５ｇ·ｋｇ－１，ｓｃ）和 ＭＳＧ＋βＥｎｄ（１０ｍｇ·ｋｇ－１，ｓｃ）３组，每组８只，每天给药一次，连续７ｄ ，ＭＳＧ在βＥｎｄ后１５ｍｉｎ注射，最后一次给药后再饲养７ｄ处死。１０％甲醛心脏灌流 ，石蜡包埋，作６μｍ厚冠状面切片，焦油紫常规染色［５］，用５４０生物医学图像分析仪对 下丘脑弓本文于１９９７年３月１１日收到。状核部位照片作图像分析。单细胞内游离钙浓度测定 用Ｄｉｌｄｙ［６］方法略加改进。急性分离新生小鼠（１～２日龄）的大脑皮层，剪碎并以终浓 度０１２５％的胰酶于３７℃消化１５ｍｉｎ，３００×ｇ离心、漂洗后细胞悬液用荧光染料Ｆ ｕｒａ２／ＡＭ（终浓度２μｍｏｌ·Ｌ－１）孵育４５ｍｉｎ（３７℃），３００×ｇ离心去 除胞外的Ｆｕｒａ２，细胞悬液１００μＬ在３７℃恒温下用ＳｐｅｘＡＲＣＭＭＩＣ阳 离子检测系统测定单个神经元内的荧光比值的变化（λｅｘ＝３４０和３８０ｎｍ，λｅｍ＝５０ ５ｎｍ），分析用药前后神经元胞内［Ｃａ２＋］ｉ的变化。βＥｎｄ含量的测定体重１５０± ５ｇ的Ｗｉｓｔａｒ大鼠，♀♂各半，随机分成生理盐水对照、ＭＳＧ（１０ｇ·ｋｇ－１，ｉ ｃｖ）和ＭＳＧ＋吗啡（１０ｍｇ·ｋｇ－１，ｉｐ）３组。吗啡于ＭＳＧ前１５ｍｉｎ给药。１ ｈ后处死动物，立即将全脑置煮沸的生理盐水中２ｍｉｎ灭活肽酶，分离下丘脑、双侧纹状体、海 马和大脑皮层，称重并匀浆，４℃下３３００×ｇ离心３０ｍｉｎ，上清贮存于－２０℃，用放射 免疫（ＲＩＡ）试剂盒，γ计数器测量，根据每次所作标准曲线的Ｂ／Ｔ值计算单位鲜脑组织的 βＥｎｄ含量［７］。结果１βＥｎｄ对ＭＳＧ导致的下丘脑损伤的影响由图１可以看出，与 对照组（Ａ）相比，ＭＳＧ组（Ｂ）下丘脑弓状核（ａｒｃｕａｔｅｎｕｃｌｅｕｓ，ＡＮ）神经 元数目减少，而注射βＥｎｄ（Ｃ）则可以加剧这种形态学变化。图像分析表明（表１），ＭＳ Ｇ可引起单位面积内神经元总面积显著缩小，而βＥｎｄ处理使上述变化更为显著，即神经元面 积显著小于ＭＳＧ组。Ｆｉｇ１ＥｆｅｃｔｓｏｆβＥｎｄｏｎＭＳＧｉｎｄｕｃｅｄｉｎｊ ｕｒｙｉｎＡＮｏｆｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓｆｒｏｍ７～９ｄｏｌｄｍｉｃｅ．ＭＳＧ（０ ５ｇ·ｋｇ－１，ｓｃ）ｗａｓｇｉｖｅｎｏｎｃｅａｄａｙｆｏｒ７ｄａｎｄβＥｎｄ（１ ０ｍｇ·ｋｇ－１，ｓｃ）ｗａｓｉｎｊｅｃｔｅｄ１５ｍｉｎｂｅｆｏｒｅＭＳＧ．Ａｌｍｉｃ ｅｗｅｒｅｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ１ｗｋａｆｔｅｒｔｈｅｆｉｎａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａ． Ｎｏｒｍａｌｎｅｕｒｏｎｓｉｎａｒｃｕａｔｅｎｕｃｌｅｕｓ（ＡＮ）ａｆｔｅｒｓｃｓａｌ ｉｎｅ；Ｂ．ＬｏｓｏｆｎｅｕｒｏｎｓｉｎＡＮａｆｔｅｒｓｃＭＳＧ；Ｃ．Ｓｅｖｅｒｅｎｅ ｕｒｏｎｌｏｓｉｎＡＮａｆｔｅｒｓｃＭＳＧ＋βＥｎｄ；ＡＮ：ａｒｃｕａｔｅｎｕａｌｅ ｕｓ；ＩＩ：ｔｈｅｔｈｉｒｄｖｅｎｔｒｉｃｌｅ；Ｂａｒ＝５０μｍ．Ｔａｂ１Ｅｆｅｃｔｏ ｆβＥｎｄｏｎＭＳＧｉｎｄｕｃｅｄｉｎｊｕｒｙａｓｅｓｅｄｂｙｉｍａｇｅａｎａｌｙ ｓｉｓｏｆｎｅｕｒｏｎａｌａｒｅａｓｉｎａｒｃｕａｔｅｎｕｃｌｅｕｓ（ＡＮ）Ｔｒｅａｔ ｍｅｎｔＮｅｕｒｏｎａｌａｒｅａｓ（μｍ２）ＮＡ／ＴＡ（％）Ｓａｌｉｎｅ４８．３±４． ０２４．４ＭＳＧ３５．０±２．３ａ１７．６ＭＳＧ＋βＥｎｄ３０．４±１．９ｂ１５．３ ＡｎｉｍａｌｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｗｅｒｅｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ１．Ｖａｌｕｅ ｓｉｎｔａｂｌｅａｒｅｘ±ｓ．ａＰ＜００１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ，ｂＰ＜００１ｖｓＭＳ Ｇ．ＮＡ：ｎｅｕｒｏｎａｌａｒｅａｓ，ＴＡ：ｔｏｔａｌａｒｅａｓ＝１９８６±８８， ｎ＝８．２细胞内游离钙浓度的变化由图２可见，随着作用时间的延长，ＭＳＧ（终浓度８５ｍ ｇ·Ｌ－１）使单个神经元内［Ｃａ２＋］ｉ不断升高，而同时加入ＭＳＧ和βＥｎｄ（终浓度 １ｇ·Ｌ－１）后第７ｍｉｎ［Ｃａ２＋］ｉ较单加入ＭＳＧ明显升高，第９ｍｉｎ，升高作用更 为明显。图３的结果表明，单独使用βＥｎｄ（终浓度２ｇ·Ｌ－１）也可以引起［Ｃａ２＋］ ｉ的升高，但作用不如ＭＳＧ（终浓度１７０ｍｇ·Ｌ－１）强，而βＥｎｄ＋ＭＳＧ诱发的 ［Ｃａ２＋］ｉ的显著变化可以被钙通道阻滞剂维拉帕米（ｖｅｒａｐａｍｉｌ，终浓度１ｇ·Ｌ －１）部分逆转。３各脑区内βＥｎｄ含量的变化放射免疫测定发现，正常情况下，下丘脑、海 马、纹状体、皮层四个脑区中βＥｎｄ含量有所不同，其中海马的含量最低；ＭＳＧ（１ｇ·ｋ ｇ－１，ｉｃｖ）处理后各脑区βＥｎｄ含量均显著升高；若预先注射阿片受体激动剂吗啡（１ ０ｍｇ·ｋｇ－１，ｉｐ），则除海马外，各脑区内βＥｎｄ含量又进一步升高（图４）。Ｆｉ ｇ２Ｔｉｍｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｈａｎｇｅｓｏｆ［Ｃａ２＋］ｉｉｎｄｕｃｅｄｂｙＭＳ Ｇ（８５ｍｇ·Ｌ－１）ｉｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｒｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆβＥｎｄ（１ ０ｇ·Ｌ－１）．Ｖａｌｕｅｓｉｎｆｉｇｕｒｅａｒｅｘ±ｓ．ａＰ＜００５ｖｓｃｏｎｔ ｒｏｌ，ｂＰ＜００５，ｃＰ＜００１ｖｓＭＳＧ（１ｍｉｎ），ｂ′Ｐ＜００５ｖｓＭＳ Ｇ（７ｍｉｎ），ｃ′Ｐ＜００１ｖｓＭＳＧ（９ｍｉｎ），ｄ′Ｐ＜００１ｖｓＭＳＧ（１ １ｍｉｎ），ｎ＝２０．Ｆｉｇ３ＥｆｅｃｔｓｏｆβＥｎｄｏｎＭＳＧｉｎｄｕｃｅｄｉｎ ｃｒｅａｓｅｉｎ［Ｃａ２＋］ｉ．ＮｅｕｒｏｎｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈＭＳＧ （１７ｍｇ·Ｌ－１），βＥｎｄ（２０ｇ·Ｌ－１）ｏｒｂｏｔｈＭＳＧａｎｄβＥｎｄ ｉｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｒｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｖｅｒａｐａｍｉｌ（１０ｇ·Ｌ－１） ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｘ±ｓ．ａＰ＜００５ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ，ｂＰ＜００１ｖｓβＥ ｎｄ，ｃＰ＜００１ｖｓＭＳＧ，ｄＰ＜００１ｖｓＭＳＧ＋βＥｎｄ，ｎ＝２０～２５． Ｖｅｒ＝ｖｅｒａｐａｍｉｌ．Ｆｉｇ４ＣｈａｎｇｅｓｏｆβＥｎｄｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｖ ａｒｉｏｕｓｂｒａｉｎａｒｅａｓｏｆｍｏｕｓｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＭＳＧ（１ｇ·ｋｇ－１ ，ｉｃｖ）ｏｒＭＳＧ＋ｍｏｒｐｈｉｎｅ（１０ｍｇ·Ｌ－１，ｉｐ）．Ｍｏｒｐｈｉｎｅｗｅ ｒｅｉｎｊｅｃｔｅｄ１５ｍｉｎｐｒｉｏｒｔｏＭＳＧ．Ｖａｌｕｅｓａｒｅｘ±ｓ．ａＰ＜０ ０５，ｂＰ＜００１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ，ａ′Ｐ＜００５，ｂ′Ｐ＜００１ｖｓＭＳＧ ，ｎ＝６．Ｈｙｐｏ＝ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ，Ｈｉｐ＝ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．讨论自１ ９５０年Ｏｌｎｅｙ等人报道谷氨酸单钠能引起神经元损伤以来，兴奋性氨基酸神经毒性作用及其 机制已成为神经科学领域的研究热点，目前已公认，神经元损伤与胞内钙稳态破坏有关［８］。因 此，检测［Ｃａ２＋］ｉ的变化对探讨神经元损伤的致因及药物作用机制有重要意义。本实验室曾 报道外源性阿片受体激动剂吗啡能增强谷氨酸单钠的神经毒性，其机制与通过脑内阿片受体影响［ Ｃａ２＋］ｉ及谷氨酸受体数目的上调有关［４，９］。βＥｎｄ是哺乳动物脑内含量丰富的内 源性阿片肽之一，有广泛的生理作用，因此脑内βＥｎｄ含量的异常增多是否也影响谷氨酸的神 经毒性作用值得重视。上述体外和体内实验结果表明，βＥｎｄ与吗啡一样可以明显增强谷氨酸 单钠诱发的下丘脑弓状核神经元的损伤。［Ｃａ２＋］ｉ的检测表明，βＥｎｄ对谷氨酸神经毒 性的影响与其导致［Ｃａ２＋］ｉ的失调有关，且这种作用有一定的时程特性。维拉帕米可部分逆 转βＥｎｄ与ＭＳＧ共同产生的神经毒性作用，提示这种神经毒性作用的机制与电压依赖性Ｌ型 钙通道激活有关。本研究还发现ＭＳＧ能诱发下丘脑、皮层等脑区βＥｎｄ的含量增加，这可能 与谷氨酸参与下丘脑神经元内分泌系统的调节有关。有趣的是，外源性阿片受体激动剂吗啡可与Ｍ ＳＧ共同作用，使上述脑区的βＥｎｄ含量进一步增加，这也许与吗啡增强谷氨酸神经毒性的机制有关。参考文献１ＭｅｌｄｒｕｍＢ，ＧａｒｔｈｗａｉｔｅＪ．Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙａｍｉｎｏａｃｉｄｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ．ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃａｌＳｃｉ，１９９０，１１∶３７９２ＷｕＪ，ＧａｏＪ
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