钙离子与牛磺酸两者跨心肌细胞膜内流的相互影响上海市心血管病研究所，上海医科大学附属中山医 院（上海２０００３２）宿燕岗杨英珍郭棋陈灏珠中国科学院上海细胞生物学研究所（上海２００ ０３１）顾全保赵剑星摘要目的和方法：取新生ＳＤ大鼠心室肌制备培养搏动心肌细胞，采用放射 性同位素４５Ｃａ２＋及３Ｈ－牛磺酸示踪技术，观察钙离子与牛磺酸跨心肌细胞膜内流的相互影 响。结果：（１）牛磺酸内流在低胞外Ｃａ２＋浓度（［Ｃａ２＋］ｏ，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）和 高［Ｃａ２＋］ｏ（４０ｍｍｏｌ／Ｌ）均比正常［Ｃａ２＋］ｏ（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）和高 ［Ｃａ２＋］ｏ（４０ｍｍｏｌ／Ｌ）时增加，尤以低［Ｃａ２＋］。时明显；异搏定（１０μ ｍｏｌ／Ｌ）能促进牛磺酸的内流；（２）１０～２０ｍｍｏｌ／Ｌ牛磺酸对不同［Ｃａ２＋］。 （０５、１５和４０ｍｍｏｌ／Ｌ）下的Ｃａ２＋内流均有抑制作用，而１ｍｍｏｌ／Ｌ牛 磺酸只抑制高［Ｃａ２＋］ｏ时Ｃａ２＋内流，对低［Ｃａ２＋］ｏ和正常［Ｃａ２＋］ｏ时Ｃａ ２＋内流无明显作用；１～２０ｍｍｏｌ／Ｌβ－丙氨酸对Ｃａ２＋内流无明显影响。结论：胞外 Ｃａ２＋浓度的变化可直接影响牛磺酸内流，而牛磺酸能抑制Ｃａ２＋的内流，两者相互影响，从 而发挥牛碘酸调节细胞内Ｃａ２＋浓度的作用。主题词大鼠；心肌；细胞，培养的；钙；牛磺酸牛 磺酸（ｔａｕｒｉｎｅ）是正常存在于体内的含硫氨基酸，占心肌游离氨基酸的５０％以上。有大 量实验资料证实牛磺酸对心肌依赖于Ｃａ２＋的生理和病理现象具有明显的调节作用，是机体内源 性Ｃａ２＋稳态调节剂［１］。另外，心肌细胞膜上存在Ｎａ＋／牛磺酸共同转运系统，牛磺酸跨 膜转运是Ｎａ＋依赖性的［２］，因此推测Ｃａ２＋同样可能影响牛磺酸的跨膜转运。，本实验拟 利用放射性同位素４５Ｃａ２＋、３Ｈ－牛磺酸作为示踪物，观察两者在培养大鼠搏动心肌细胞膜 上跨膜内流的相互影响。材料和方法１原代心肌细胞的制备和培养：无菌取出生１～３ｄ的Ｓｐ ｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠之心室肌，用０１％胰蛋白酶分次消化。收集分离的心肌细胞， 分装于２４孔培养板中，５×１０５个细胞／孔。生长液为含２０％小牛血清的Ｅａｇｌｅ’ｓＭ ＥＭ液，详细步骤参考Ｙａｎｇ等的方法［３］。２实验分组：实验分２部分。（一）：牛磺酸 内流部分。１测定不同胞外Ｃａ２＋浓度（［Ｃａ２＋］）ｏ，即低［Ｃａ２＋］ｏ（０５ｍ ｍｏｌ／Ｌ）、正常［Ｃａ２＋］ｏ（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）和高［Ｃａ２＋］ｏ（４０ｍｍｏ ｌ／Ｌ）情况下，对培养心肌细胞牛磺酸内流的影响；２观察１、１０μｍｏｌ／Ｌ异搏定（ｖ ｅｒａｐａｍｉｌ，Ｖｅｒ）对牛磺酸内流的影响；（二）：Ｃａ２＋内流部分。１测定１、１ ０和２０ｍｍｏｌ／Ｌ牛磺酸（Ｓｉｇｍａ公司产品）在上述不同［Ｃａ２＋］ｏ情况下，对培养 心肌细胞Ｃａ内流的影响；２测定１、１０和２０ｍｍｏｌ／Ｌβ－丙氨酸（Ｓｉｇｍａ公司产 品）对心肌细胞Ｃａ２＋内流的影响；其中，各不同浓度的牛磺酸及β－丙氨酸分别用含相应不同 浓度Ｃａ２＋的Ｒｉｎｇｅｒ液（ＮａＣｌ：１２０；ＫＣｌ∶３０；ＭｇＣｌ２∶３４；Ｈ ＥＰＥＳ：５０，葡萄糖１５，ＣａＣｌ２分别为０５、１５和４０，单位均为ｍｍｏｌ ／Ｌ，ｐＨ调至７４）配制。３牛磺酸内流的测定：心肌细胞在培养７２ｈ后，用无Ｃａ２＋ －Ｔｒｉｓ洗涤３次，Ｖｅｒ用含１５ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃａ２＋－Ｔｒｉｓ释释成所需浓度并预 作用２０ｍｉｎ，然后加入不同Ｃａ２＋浓度的Ｔｒｉｓ（０５、１５和４０ｍｍｏｌ／Ｌ ）和含有３Ｈ－牛磺酸（１０ｍＣｉ／Ｌ）的流量测定液２００μＬ／孔，开始计时。流量测定 系统中的非放射性牛磺酸浓度为１００μｍｏｌ／Ｌ，３７℃温育震荡６０ｍｉｎ后取出培养板， 弃上清，用流量测定液（冰浴）快速洗涤３次，加５％ＳＤＳ０５ｍＬ／孔，室温放置。２ｈ后 混匀取出２００μＬ／孔加在计数杯内，并加闪烁液２５ｍＬ，用ＢｅｃｋｍａｎＬＳ６５００ 计数ｃｐｍ。４Ｃａ２＋内流的测定：心肌细胞在培养７２ｈ后，用无Ｃａ２＋－Ｒｉｎｇｅｒ 液洗涤３次，分别加入各不同浓度的牛磺酸和β－丙氨酸预作用３０ｍｉｎ。然后弃上清，加入含 ４５Ｃａ２＋（１×１０３μＣｉ／Ｌ，Ｄｕｐｏｎｔ公司产品）的上述含不同浓度非放射性Ｃａ ２＋、牛磺酸和β－丙氨酸的溶液，３７℃温育震荡３０ｍｉｎ后各孔用含１ｍｍｏｌ／Ｌ镧离子 的７％的山梨醇快速洗涤３次（冰浴），其余步骤同３。牛磺酸及Ｃａ２＋通透细胞膜内流量的计 算方法基本上参考前文［４］。以ｎｍｏｌ／ｍｇ蛋白为计算单位；Ｌｏｗｒｙ法［５］测各孔蛋 白质的含量。结果（一）钙离子对大鼠培养心肌细胞牛磺酸内流的影响：结果如图１所示，可见与 正常［Ｃａ２＋］ｏ相比，低［Ｃａ２＋］ｏ和高［Ｃａ２＋］ｏ均能促进牛磺酸内流，尤以低［ Ｃａ２＋］ｏ时明显。Ｆｉｇ１Ｅｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎ ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔａｕｒｉｎｅｉｎｆｌｕｘｉｎｒａｔｃｕｌｔｕｒｅｄｃａｒｄｉ ｏｍｙｏｃｙｔｅｓＣｈａｒｔＡ、ＢａｎｄＣｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔａｕｒｉｎｅｉｎｆｌｕｘ ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ０．５、１５ａｎｄ４０ｍｍｏｌ／Ｌｏｆｅｘｔｒａｃ ｅｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｘ±ｓ，ｎ＝６，ｔｈｅｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓｒｅｉｔｅｒａｔｉｖｅｌｙ ．Ｐ＜００５，Ｐ＜００１ｖｓＢ图１细胞外钙离子浓度对正常大鼠培养心肌细胞牛 磺酸内流的影响（二）异搏定对大鼠培养心肌细胞牛磺酸内流的影响：１μｍｏｌ／Ｌ异搏定对牛 磺酸内流（０２３１±００３７）ｎｍｏｌ·ｍｇ－１ｐｒｏｔｅｉｎ·６０ｍｉｎ－１与对 照组（０２２７±００３９）无明显影响；而１０μｍｏｌ／Ｌ异搏定能明显促进牛磺酸内流 （０３５３±００４２），与对照组相比，差异非常显著（Ｐ＜００１）。（三）牛磺酸对 大鼠培养心肌细胞钙离子内流的影响：由图２看出，Ｃａ２＋内流量与［Ｃａ２＋］ｏ呈正相关， 牛磺酸能抑制Ｃａ２＋内流，并呈剂量依赖效应，且对高［Ｃａ２＋］ｏ情况下Ｃａ２＋内流的抑 制作用尤为明显。１０和２０ｍｍｏｌ／Ｌ牛磺酸对各［Ｃａ２＋］ｏ的Ｃａ２＋内流均有抑制作 用，１０ｍｍｏｌ／Ｌ牛磺酸对［Ｃａ２＋］。为０５、１５和４０ｍｍｏｌ／Ｌ时Ｃａ２ ＋内流的抑制率分别为１８２、１９４和３１７％，２０ｍｍｏｌ／Ｌ牛磺酸时的抑制率分 别为２９１、２６２和３５９％，而１ｍｍｏｌ／Ｌ牛碘酸只对高［Ｃａ２＋］ｏ情况下Ｃ ａ２＋内流具有抑制作用，对低［Ｃａ２＋］ｏ和正常［Ｃａ２＋］ｏ时Ｃａ２＋内流无明显作用 。Ｆｉｇ２Ｅｆｅｃｔｏｆｔａｕｒｉｎｅｏｎｃａｌｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘｉｎｒａｔｃｕｌｔ ｕｒｅｄｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓＬｉｎｅＡ、Ｂ、ＣａｎｄＤｒｅｐｒｅｓｅｎｔｃａｌ ｃｉｕｍｉｎｆｌｕｘｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ０、１、１０ａｎｄ２０ｍｍｏｌ／Ｌｏ ｆｔａｕｒｉｎｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｘ±ｓ，ｎ＝４，ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎ ｔｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓｒｅｉｔｅｒａｔｉｖｅｌｙ．Ｐ＜０ ０５ｖｓＢ，Ｐ＜００１ｖｓＣａｎｄＤ；▲Ｐ＜００５ｖｓＣａｎｄＤ；＃Ｐ＜０ ０５ｖｓＣ，＃＃Ｐ＜００１ｖｓＤ．图２牛磺酸对正常大鼠培养心肌细胞钙离子内流的影响（ 四）β－丙氨酸对正常大鼠培养心肌细胞钙离子内流的影响：由上述实验结果，我们选择［Ｃａ２ ＋］ｏ为４０ｍｍｏｌ／Ｌ。结果显示：１０和２０ｍｍｏｌ／Ｌβ－丙氨酸处理组与对照组Ｃ ａ２＋内流量无明显差别。讨论本实验发现大鼠培养心肌细胞牛磺酸跨膜内流速度在低［Ｃａ２＋ ］ｏ和高［Ｃａ２＋］ｏ情况下均比正常［Ｃａ２＋］ｏ时增加，尤其在低［Ｃａ２＋］ｏ时明显 ，增加幅度分别为７０％和１３％。本实验尚观察到高浓度Ｖｅｒ能加速牛磺酸内流速度，其机理 尚不清楚。已知细胞膜上存在依赖于Ｎａ＋的牛磺酸转运蛋白［６］，［Ｃａ２＋］ｏ的变化或钙 通道阻滞剂的应用可能间接影响了牛磺酸转运蛋白的结构和／或功能或通过影响Ｎａ＋而直接改变 了牛磺酸转运蛋白的活性，详细机制有待进一步阐明。Ｓａｗａｍｕｒａ等［７］在离体豚鼠单心 室肌细胞上利用电压钳技术发现牛磺酸能促进低［Ｃａ２＋］ｏ时Ｃａ２＋内向电流（ＩＣａ）， 抑制高［Ｃａ２＋］ｏ时ＩＣａ，对正常［Ｃａ２＋］ｏ时的ＩＣａ无影响。本实验发现高浓度牛 磺酸（１０和２０ｍｍｏｌ／Ｌ）能抑制低、正常和高［Ｃａ２＋］ｏ时Ｃａ２＋内流，对高［Ｃ ａ２＋］时Ｃａ２＋内流的抑制作用尤明显，而１ｍｍｏｌ／Ｌ牛磺酸只对高［Ｃａ２＋］ｏ时Ｃ ａ２＋内流有抑制作用，对低和正常［Ｃａ２＋］ｏ时无明显影响，与Ｓａｗａｍｕｒａ的报道有 不同之处。这可能与所采用的实验方法、药物浓度及标本来源等不同有关。β－丙氨酸是牛磺酸的 类似物。本实验发现１～２０ｍｍｏｌ／Ｌβ－丙氨酸对Ｃａ２＋内流无明显影响，提示牛磺酸对 Ｃａ２＋内流的作用具有结构特异性。牛磺酸调节Ｃａ２＋转运的具体部位目前尚不清楚。细胞内 高浓度的牛磺酸和正常浓度Ｃａ２＋对维持心肌细胞功能起重要的作用。低［Ｃａ２＋］ｏ和高［ Ｃａ２＋］ｏ能促进牛磺酸内流，而高浓度的牛磺酸能抑制Ｃａ２＋的内流，稳定细胞内Ｃａ２＋ 含量。新近我们发现牛磺酸亦能抑制心肌细胞感染病毒后Ｃａ２＋内流的增加［８］。本实验结果提示，Ｃａ２＋与牛磺酸跨膜内流之间相互影响，从而发挥牛磺酸调节细胞内Ｃａ２＋浓度的作用。参考文献１ＳａｔｏｈＨ．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｃｔｉｏｎｓｏｆｔａｕｒｉｎｅａｇａｉｎｓｔｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕ
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