新生隐球菌(新隐)是临床常见的条件致病真菌,其对脑部的感染较凶险,致死性高<1>。在医源 因素(药物和试剂)作用下,该酵母菌的宿主细胞粘附性及其它表面生物特性(ＣＳＨ及荚膜)的 变化具有重要意义,对阐明新隐的条件致病机理和制定防治方案亦有重要价值。本研究基于上述观 念来观察新隐的宿主粘附性、ＣＳＨ和荚膜之间的关系,现报道如下。材料和方法1.ｖｅｒｏ细 胞传代单层培养<2>:ｖｅｒｏ细胞株原培养用01%胰酶消化分散,用1640培养液调细胞 浓度至1×105细胞/ｍｌ,加01ｍｌ至96孔板各孔,5%ＣＯ2湿温(37℃)孵育,至 第5天融合成单层,倾出培养液,用006ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ738)轻吸洗细胞表面1次 ,作为宿主细胞备用。2.新隐孢子悬液制备及预作用:常规复活保存菌种新隐ＩＦＭ5833, 移至Ｌｅｅ液基(37℃,孵育18小时,100ｒ/ｍｉｎ),弃液收集菌,用ＰＢＳ调孢子浓 度为42×107孢子/ｍｌ,分为两份分别作ＣＳＨ和粘附试验测试备用。用于做粘附试验的孢 子悬液每10ｍｌ中加入12μｌ3Ｈ亮氨酸液,方法和试验同文献<3>。标记好的悬液调至原 孢子浓度,为3Ｈ标悬液备用。用20种药物和化学试剂(名称见附表)各按1∶5、1∶50及 1∶500生理盐水稀释后,再各加入等体积的3Ｈ标记和非标记孢子悬液,混合后的药剂浓度为 1∶10、1∶100及1∶1000,各药剂作用2小时(37℃,100ｒ/ｍｉｎ),ＰＢ Ｓ1000倍稀释离心弃药剂(1500ｒ/ｍｉｎ)2次,再用ＰＢＳ氯化钙混合液调作用后的 孢子浓度至原悬液浓度,分别作为ＣＳＨ和粘附试验的测试备用,并设相应正常无药剂作用对照组 。附表 药物和化学试剂对新生隐球菌的表面疏水性和粘附性的影响药物和化学试剂表面疏水性( %)粘附率(%) ｘ±ｓＰｘ±ｓＰ凝血素618±205<005105±11<005刀豆 蛋白Ａ324±267>00577±14<005植物血凝素185±13<00159±18 <005岩藻糖122±117<00548±11<001木瓜蛋白酶205±145<005 21±04<001β巯基乙醇163±65<00128±03<001几丁质酶212±93 <005113±15<005胰 酶351±129>00523±05<001环磷酰胺4 36±295>00141±07<001甲氨蝶呤67±50<00157±01<001青霉 素Ｇ275±135>02588±03>005红霉素135±62<00172±06<00 2氨苄青霉素348±187>00591±08>005二性霉素Ｂ57±12<00152± 12<001氟康唑810±37<00136±15<001氢化可的松184±97<005 84±05>005黄体酮111±22<00176±06<005地塞米松182±135> 00579±06<005β雌二醇120±08<00189±10>005甲基睾丸素225 ±05<00182±01>005正常对照390±48-91±20-〗空白对照 0-- - 不同稀释作用组均数与正常对照均数的两样本ｔ检验 3.粘附试验及其测定<2>:在制 备好的96孔板单层培养ｖｅｒｏ细胞孔中,各对号加入3Ｈ标药剂预处理后的各孢子悬液01ｍ ｌ,置37℃温育(5%ＣＯ2)1小时,ＰＢＳ液轻吸洗各孔3次,弃未粘附孢子,各孔再加入 70%过氯酸005ｍｌ和30%过氧化氢01ｍｌ消化ｖｅｒｏ细胞,方法见文献<3>。用Ｄ ＹＱ01型多头细胞样品收集粘附孢子,再测各样品每分钟放射计数(ｍｉｎ-1),按下式换算 :粘附率=粘附孢子ｃ·ｍｉｎ-1悬液ｃ·ｍｉｎ-1×100%。各管行双管测试,并设无药 剂作用对照。4.ＣＳＨ测定<4>:用未标记的预作用悬液各对号加入3ｍｌ至酸处理空管中, 再加入液态正十六烷(16℃),旋转混匀1分钟(其间停5秒钟),静置10分钟使脂水相分层 ,吸取管底水相液约2ｍｌ在石英测试杯中,于600ｎｍ波长处测各作用管的Ａ值(曾称ＯＤ值 ),按下式换算ＣＳＨ%=(1-水相Ａ值悬液Ａ值)×100%,空白对照用ＰＢＳ液,行双管 测试。二性霉素Ｂ和氟康唑预作用的孢子悬液还行恢复性生长培养,分为0小时、24小时、48 小时及72小时,各期的ＣＳＨ测定同前述,并有培养生长情况的观察。5.电镜观察:均用无3 Ｈ标记预作用管(1∶1000稀释度)、恢复性培养期(72小时)及正常对照作标本,按常规 电镜标本处理,行透射和扫描电镜检查。6.统计学处理:各组管的ＣＳＨ(%)和粘附率计算均 数(ｘ±ｓ),并做均数ｔ检验。计算ＣＳＨ与粘附率的相关系数。结 果1.新隐的ＣＳＨ和 粘附率变化:由附表可见,引起ＣＳＨ较高(60%及其以上)的氟康唑和凝血素各致新隐高低不 一的粘附率。在使ＣＳＨ变化不大(30%<ＣＳＨ<60%)的药剂中,刀豆蛋白Ａ、胰酶、环 磷酰胺及地塞米松均不同程度地降低了粘附率,青霉素及氨苄青霉素对粘附无影响。在使ＣＳＨ降 低(<30%)的药剂中,木瓜蛋白酶、β巯基乙醇、岩藻糖、二性霉素Ｂ、植物血凝素、红霉素 、甲氨蝶呤及黄体酮均致粘附率不同程度地降低。可见,部分药剂一致性降低新隐的ＣＳＨ和粘图 1 新生隐球菌胞壁正常形态图2 新生隐球菌孢子粘附于ｖｅｒｏ细胞表面图3 氨苄青霉素作 用新生隐球菌后胞壁形态图4 雌二醇作用后新生隐球菌胞壁形态图5 二性霉素Ｂ作用新生隐球 菌的恢复生长胞壁形态附性。几丁质酶降低ＣＳＨ,增高粘附率,说明该酶底物不是胞壁粘附介导 物成分。综上所述,药物和试剂预作用新隐后,造成ＣＳＨ和粘附率的变化呈不均一的反应,二者 间的相关性低(ｒ=-00899,Ｐ≤005)。2.新隐的荚膜、粘附率及ＣＳＨ的超微形态 变化及抗真菌药作用后的恢复性生长:正常无药剂作用的新隐细胞形态如图1,它能牢固粘附于ｖ ｅｒｏ细胞表面(图2)。使荚膜丧失的氨苄青霉素(图3)、二性霉素Ｂ及氟康唑均有高低不一 的ＣＳＨ和粘附率变化,仅二性霉素Ｂ使ＣＳＨ和粘附率均降低(见附表)。氨苄青霉素和二性霉 素Ｂ可使胞壁外层光亮反应(图4),二药均使ＣＳＨ呈低值,氟康唑增高ＣＳＨ,无上述壁外层 特征性改变。雌二醇、地塞米松及甲氨蝶呤均降低ＣＳＨ和粘附率,伴有类似氨苄青霉素所致的胞 壁外层光亮区改变(图3、4),并对荚膜的影响甚小或无。可见荚膜与ＣＳＨ和粘附性变化的关 系不明显,三者的致病关系也不清楚。抗真菌药二性霉素Ｂ和氟康唑作用新隐后的恢复性生长及伴 随的ＣＳＨ变化表现在:随着生长菌量的增多和ＣＳＨ恢复至正常水平,其相应形态变化也会得到 恢复,并有荚膜形态再生(图5)。说明ＣＳＨ、胞壁形态变化及荚膜改变都是可逆的。讨 论 本次观察结果显示,药物和试剂作用可引起新隐ＣＳＨ和其宿主粘附性的反应呈高度不一致性,Ｃ ＳＨ伴随的胞壁形态变化和荚膜改变均是可逆的,荚膜与ＣＳＨ和粘附性的关系不明确,后者与先 前报道相似<5>。从结果分析看,两种抗真菌药物均使ＣＳＨ和粘附性发生不一致的改变,胞壁 形态变化也各异,伴有荚膜丧失,但这些变化都是可逆的,其原因可能是暂时的环境变化促成新隐 表面的各种生理和形态方面的短时改变,以适应此环境,随之也发生了可逆性的致病性改变,这对 揭示该菌的感染机制有一定的现实意义。抗癌药(甲氨喋呤和环磷酰胺)作用也无明显的一致性结 果,说明宿主免疫力受抑是感染存在的重要诱因。三种抗细菌抗生素作用对该菌的ＣＳＨ和宿主粘 附性的影响甚微,但氨苄青霉素可使胞壁形态和荚膜出现类似二性霉素Ｂ所致的改变,这一现象的 意义还不清楚,提示抗细菌剂主要是通过抑制其它正常菌群而诱发该菌感染的。糖皮质激素和性激 素作用均引起ＣＳＨ降低,但对宿主粘附无影响,显示有促进感染的作用。蛋白质破坏性试剂(巯 基乙醇、胰酶及木瓜蛋白酶)可引起粘附率及ＣＳＨ下降或不变,说明蛋白质是胞壁粘附介导成分 的组成之一。几丁质酶和木瓜蛋白酶引起粘附性变化高低不一,而使ＣＳＨ均降低,说明ＣＳＨ和 粘附性的胞壁结构成分的物质基础是不同的。凝血素能结合甘露聚糖,但不阻止新隐粘附,说明该 菌的胞壁粘附介导成分无甘露聚糖。岩藻糖和植物血凝素均可降低粘附性,证实新隐胞壁粘附介导 成分仍与其它糖配体有关,有待进一步证实。药物和化学试剂体外对新生隐球菌的细胞表面疏水性 和粘附性的影响@侯幼红$广州市皮肤病防治所!510095@郭宁如!210042南京$中 国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所@吴绍熙!210042南京,指导$中国医学科 学院、中国协和医科大学皮肤病研究所新生隐球菌;;细胞表面疏水性;;粘附性;;荚膜目的 为探讨新生隐球菌(新隐)的细胞表面疏水性(CSH)与其宿主细胞粘附性的致病关系。方法 于体外用药物和化学试剂预先作用新隐来观察医源因素(药物等)对该菌的CSH、宿主细胞粘附 性及荚膜的影响。在低浓度和短时间内先行药物和化学试剂(药剂)预处理该菌,再做其CSH、 粘附率及超微形态的测试。结果 抗真菌剂二性霉素B和氟康唑均使该菌粘附降低,而致CSH呈 高低不一变化。氨苄青霉素对CSH和粘附性均无明显影响,但可产生类似二性霉素B所致的胞壁 外层特征形态变化和无荚膜改变,而这些变化是可逆的。氟康唑致无胞壁特征性变化和无荚膜改变。植物血凝素、刀豆蛋白A、岩藻糖、巯基乙醇及胰酶均致CSH和粘附降低,凝血素增加粘附率。结论 新生隐球菌的CSH、宿主粘附性及荚膜之间无致病相关性,各为独立的表面生物特性。1BulmerGS.TwentyfiveyearswithCryptococcusneoformans.Mycopathologia,1 990 ,1 0 9∶1 1 1 1 2 2 .
2KennedyMJ.Modelsforstudyingtheroleoffungalattachmentincolonizationandpa
More abstracts about the 药物和化学试剂体外对新生隐球菌的细胞表面疏水性和粘附性的影响