再障Ⅰ号对放射损伤小鼠骨髓基质细胞层粘附功能的影响作者简介：黄伟，男，２８岁，硕士，主要 从事中西医结合治疗血液病的研究；何美冬，６５岁，女，硕士生导师，教授，主要研究再障中西 医结合治疗黄伟何美冬吴汉卿（同济医科大学附属同济医院中医科，武汉４３００３０）中国图书 分类号Ｒ９７７．８我们根据“益气、补肾、活血、清解”４法联用而确立的中药“复方再障Ⅰ号 ”在临床上治疗再生障碍性贫血（以下简称再障）取得了肯定疗效，其近期有效率为９０．３２％ ，治愈缓解率为５８．０６％〔１〕，以前的实验研究也表明再障Ⅰ号对放射损伤小鼠的ＣＦＵ－ Ｓ、ＣＦＵ－ＧＭ及骨髓微血管系统有保护作用〔２〕。在此基础上，我们采用急性放射损伤模型 研究再障Ⅰ号对骨髓成纤维祖细胞（ＣＦＵ－Ｆ）集落及培养的骨髓质细胞层对骨髓有核细胞的粘 附能力的影响，进一步阐明再障Ⅰ号治疗机理。１材料与方法１．１实验动物清洁级昆明小鼠３６ 只，同批鼠龄７～８ｗ，体重１８～２０ｇ，雌雄各半，由同济医科大学动物实验中心提供。１． ２药物再障Ⅰ号由黄芪、大云、丹参、金银花等１０味中药组成，经同济医院制药厂制备成１００ 腹腔注射液（１ｍｌ注射液含生药１ｇ）。１．３照射剂量６０Ｃｏγ射线１次全身均匀照射，每 只小鼠吸收剂量为８Ｇｙ，吸收剂量为０．４３Ｇｙ／ｍｉｎ。１．４实验分组及处理将小鼠随机 分为３组，每组１２只小鼠。正常组（未照射组Ｎ）：腹腔注射ＮＳ每只０．３ｍｌ／ｄ，共计７ ｄ；中药组（ＺＣ）：照射后当日腹腔注射再障Ⅰ号０．３ｍｌ／只，每天１次，连续７ｄ；对照 组（Ｃ）：照射后腹腔注射生理盐水０．３ｍｌ／只，每天１次，连续７ｄ。１．５试剂与仪器Ｒ ＰＭＩ１６４０培养液，２０％小牛血清，青霉素，链霉素（以上由Ｇｉｂｃｏ公司提供），氢化 可的松（Ｓｉｇｍａ公司产品），淋巴细胞分离液（上海试剂二厂生产），倒置显微镜（Ｏｌｙｍ ｐｕｓ）。１．６外周血白细胞计数和骨髓有核细胞计数照射后第７天从尾静脉取血，用标准方法 计数外周血白细胞，颈椎脱臼处死小鼠，立即无菌条件下取出双侧股骨，用带有５号针头的注射器 吸收ＲＰ－ＭＩ１６４０液，彻底冲洗股骨髓腔，将骨髓细胞收集在灭菌离心管内，并反复冲打， 使骨髓细胞充分分散，用淋巴细胞分离液分离并洗涤２次，加入适量培养液充分混匀，制成悬液计 数，取１滴台盼蓝鉴定细胞活性在９５％以上，计数骨髓有核细胞数（ＢＭＣ）。１．７骨髓成纤 维祖细胞（ＣＦＵ－Ｆ）培养按唐法建立培养体系〔３〕，加入制备好的骨髓有核细胞悬液，使细 胞浓度达２×１０６／ｍｌ，将上述细胞悬液１ｍｌ接种于２４孔培养板中，置于３７℃含５０％ 的ＣＯ２，３７℃饱和湿度培养箱中培养，每周半量换液１次，１２～１４ｄ于倒置显微镜下计数 成纤维祖细胞集落（ＣＦＵ－Ｆ），第４周基质形成后作粘附能力测定。１．８骨髓有核细胞对骨 髓基质细胞层粘附能力的测定按上法作小鼠骨髓成纤维祖细胞培养，２８ｄ基质形成后，用１６４ ０液轻轻冲洗２次，以弃去悬浮细胞，在培养的基质细胞层中，加入浓度为５×１０６ｍｌ的正常 同系小鼠骨髓有核细胞悬液１ｍｌ（含２０％小牛血清），在培养箱中培养２ｈ后，用ＲＰＭＩ１ ６４０培养液轻轻冲洗２次，收集并计数未粘附的骨髓有核细胞，骨髓有核细胞对骨髓培养的基质 细胞层的粘附能力：（１－未粘附细胞数／５×１０６）×１００％。１．９统计学方法数据以均 数±标准差（ｘ±ｓ）表示，用ｔ检验。２结果２．１各组外周血白细胞及骨髓有核细胞数比较对 照组及中药组外周血细胞计数与骨髓有核细胞数均显著低于正常组（Ｐ＜０．０１），但中药组高 于对照组并有显著性差异（Ｐ＜０．０１），（见表１）。２．２各组ＣＦＵ－Ｆ集落计数及基质 细胞层粘附能力比较对照组ＣＦＵ－Ｆ集落数显著低于正常组（Ｐ＜０．０１），中药组ＣＦＵ－ Ｆ集落数显然也低于正常组（Ｐ＜０．０５），但却明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）。对照组基 质细胞层粘附能力显著低于正常组（Ｐ＜０．０１），中药组显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）， 与正常组比较无显著差异（Ｐ＞０．０５），见表２。表１外周血白细胞及骨髓有核细胞计数的比 较（ｘ±ｓ）Ｔａｂ．１ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＷＢＣａｎｄＢＭＣ（ｘ±ｓ）ｎＷＢＣ（× １０９／Ｌ）ＢＭＣ（×１０７／ｂｏｎｅ）Ｎ１２７．０５±０．４５１．７１±０．０３Ｃ１ ２１．９１±０．１１１）０．８７±０．１０１）ＺＣ１２３．９１±０．４８１）２）１．４ １±０．１０１）２）Ｎｏｔｅ：１）ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＮ，Ｐ＜０．０１；２）ｃｏｍ ｐａｒｅｄｗｉｔｈＣ，Ｐ＜０．０１表２ＣＦＵ┐Ｆ集落计数及基质粘附能力（ｘ±ｓ）Ｔａｂ ．２ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＣＦＵ┐Ｆａｎｄａｄｈｅｓｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎ（ｘ±ｓ） Ｎ（ｎ＝１０）Ｃ（ｎ＝１０）ＺＣ（ｎ＝１０）ＣＦＵ－Ｆ９５．０±７．５１３８．４±３． １０１）８０．４±３．７０１）４）Ａｄｈｅｓｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎ６５．０１％±５．５ ７％４７．６９％±４．３０％２）６０．９０％±４．６８％３）Ｎｏｔｅ：１）ｃｏｍｐａｒ ｅｄｗｉｔｈＮＰ＜０．０５；２）ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＮＰ＜０．０１；３）ｃｏｍｐａ ｒｅｄｗｉｔｈＣＰ＜０．０５；４）ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣＰ＜０．０１３讨论骨髓长期 培养体系中基质细胞层最近似于体内造血状况，是目前研究基质和造血细胞相互作用最合适的模型 ，造血干细胞需要在基质细胞层这一特定的微环境中才能生长繁殖，成纤维样细胞是具有微环境功 能的细胞，其在培养瓶底形成集落（ＣＦＵ－Ｆ）由成纤维祖细胞生成，后者为基质细胞中一种主 要成分〔３〕。因此，本实验结果说明再障Ⅰ号能刺激急性放射损伤小鼠骨髓基质细胞造血，促进 基质细胞生成，从而增强其粘附功能，放射线可损伤骨髓基质细胞层的粘附功能，造血细胞与基质 的粘附对造血生长发育至关重要，由于再障Ⅰ号能增强骨髓基质细胞层粘附功能，必然促进骨髓造 血细胞的增生。造血细胞与基质粘附不仅直接影响造血细胞在微环境中定位，增生分化，而且影响 细胞因子的分泌，例如多发性骨髓瘤细胞对正常或多发性骨髓瘤的基质培养层粘附可促进ＩＬ－６ 分泌，细胞因子反过来也影响造血细胞与基质粘附，基质细胞在含ＩＬ－４，ＴＮＦ－α培养体质 中培养４ｈ，对ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ粘附能力增加３倍，骨髓成纤维细胞表面粘附分子ＶＣ ＡＭ－１受ＩＬ－１，ＩＬ－４，ＴＮＦ－α正调节，细胞因子还可诱导ＶＣＡＭ－１在骨髓血管 内皮细胞上表达，ＩＬ－１β对骨髓基质细胞表达ＶＣＡＭ－１及ＩＣＡＭ－１有剂量依赖性调节 ，转移生长因子ＴＧＦ对ＶＣＡＭ－１表达呈负调节。可见造血细胞粘附与细胞因子之间是互相影 响，共同调节造血。我们以前研究还表明：经再障Ⅰ号治疗的急性放射损伤小鼠的ＩＬ－２及ＴＮ Ｆ水平明显回升〔４〕，而本实验已证明，再障Ⅰ号可促进基质细胞生长，调节基质细胞功能，可 能是通过促进基质细胞表面粘附分子的表达及基质蛋白的分泌，而促进基质细胞层粘附功能的改善 。至于再障Ⅰ号增强骨髓基质细胞层粘附功能是直接作用还是通过细胞因子作用尚有待进一步研究 。４参考文献１何美名，周剑锋，杨明炜ｅｔａｌ．中药复方“再障Ⅰ号”治疗再生障碍性贫血临 床及实验研究．内科急危重症杂志，１９９５；１（２）：６５２ＹＡＮＧＭｉｎｇｗｅｉ，ＨＥ Ｍｅｉｄｏｎｇ，ＬｉＭｉｎｇｚｈｅｎｅｔａｌ．Ｅｆｅｃｔｏｆｚａｉｚｈａｎｇ－Ｉ，ａＴ ｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｒｅ ｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｒａｄｉａｔｉｏｎｅｎｊｕｒｙｉｎｍｉｃｅ．ＪＴｏｎｇＪｉＭｅｄＵ ｎｉｖ，１９９４；１４：２２４３唐佩弦，杨天楹主编．造血细胞培养技术．西安：陕西科学技 术出版社，１９８５：１４７４周剑锋，何美冬．再障Ⅰ号对放射损伤小鼠的造血免疫功能恢复的 作用研究．中华放射医学与防护杂志，１９９５；１５（１）：３８再障Ⅰ号对放射损伤小鼠骨髓 基质细胞层粘附功能的影响@黄伟@何美冬@吴汉卿$同济医科大学附属同济医院中医科１何美名 ，周剑锋，杨明炜ｅｔａｌ．中药复方“再障Ⅰ号”治疗再生障碍性贫血临床及实验研究．内科急 危重症杂志，１９９５；１（２）：６５２ＹＡＮＧＭｉｎｇｗｅｉ，ＨＥＭｅｉｄｏｎｇ，Ｌｉ Ｍｉｎｇｚｈｅｎｅｔａｌ．Ｅｆｅｃｔｏｆｚａｉｚｈａｎｇ－Ｉ，ａＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｒｅｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍ ｒａｄｉａｔｉｏｎｅｎｊｕｒｙｉｎｍｉｃｅ．ＪＴｏｎｇＪｉＭｅｄＵｎｉｖ，１９９４；１ ４：２２４３唐佩弦，杨天楹主编．造血细胞培养技术．西安：陕西科学技术出版社，１９８５： １４７４周剑锋，何美冬．再障Ⅰ号对放射损伤小鼠的造血免疫功能恢复的作用研究．中华放射医 学与防护杂志，１９９５；１５（１）：３８ｓｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎ６５．０１％±５．５７ ％４７．６９％±４．３０％２）６０．９０％±４．６８％３）Ｎｏｔｅ：１）ｃｏｍｐａｒｅ ｄｗｉｔｈＮＰ＜０．０５；２）ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＮＰ＜０．０１；３）ｃｏｍｐａｒ ｅｄｗｉｔｈＣＰ＜０．０５；４）ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣＰ＜０．０１３讨论骨髓长期培 养体系中基质细胞层最近似于体内造血状况，是目前研究基质和造血细胞相互作用最合适的模型， 造血干细胞需要在基质细胞层这一特定的微环境中才能生长繁殖，成纤维样细胞是具有微环境功能 的细胞，其在培养瓶底形成集落（ＣＦＵ－Ｆ）由成纤维祖细胞生成，后者为基质细胞中一种主要成分〔３〕。因此，本实验结果说明再障Ⅰ号能刺激急性放射损伤小鼠骨髓基质细胞造血，促进基质细胞生成，从而增强其粘附功能，放射线可损伤骨髓基质细胞层的粘附功能，造血细胞与基质的粘附对造血生长发育至关重要，由于再障Ⅰ号能增强骨髓基质细胞层粘附功能，必然促进骨髓造血
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