肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）是由巨噬细胞和活化的Ｔ淋巴 细胞分泌的一种细胞因子［１］，通常对肿瘤细胞具有细胞毒性作用，而大多数正常细胞能对抗这 种细胞毒性，然而有资料显示，ＴＮＦ是血管内皮细胞（Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎ－ｄｏｔｈｅｌｉ ａｌｃｅｌ，ＶＥＣ）损伤的重要因素［２、３］，从而导致血管壁通透性改变和血栓形成。ＴＮ Ｆ可直接损伤ＶＥＣ，亦可通过其它因素或途径损伤ＶＥＣ，本研究主要从自由基的角度来探讨中 药益气活血方对ＴＮＦ损害ＶＥＣ的调节作用。１材料与方法１．１主要药品与试剂益气活血方： 由黄芪、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙、僵蚕、蒲黄等药物组成，采用水煎醇沉法制成注射剂， ｐＨ值７．２，离子强度０．０５，每毫升生药含量２ｇ。重组人肿瘤坏死因子α（ｒｈ－ＴＮＦ α）：北京邦定生物医学公司产品，批号：９６０６１８；ＲＰＭＩ１６４０培养基干粉：ＪＲＳ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司产品；ＨＥＰＥＳ：Ｇｉｂｃｏ公司产品；胰蛋白酶（Ｔｒｙｐｓｉｎ） ：Ｄｉｆｃｏ公司产品；小牛血清：杭州四季青生物材料研究所产品；２４孔细胞培养板：Ｎｕｎ ｃｌｏｎ，丹麦产；新鲜胎儿脐带：由湖南省妇幼保健院产科提供。１．２内皮细胞培养参照Ｊａ ｆｅ等方法［４］。选用６ｈ内新生儿脐带，在无菌条件下，以Ｄ－Ｈａｎｋ＇ｓ液洗净脐带表面 血迹，并冲洗脐静脉至发白、洗出液无色透明为止。注入０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ，３７℃孵育 １０ｍｉｎ，立即收集消化液于含４ｍｌ完全培养基（基础培养基加２０％小牛血清。基础培养基 ：１０．４ｇＲＰＭＩ１６４０粉；ＮａＨＣＯ３２ｇ，分析纯；青霉素１００万单位；链霉素１ ００万单位；ＨＥＰＥＳ２．９５ｇ；新鲜冷却三蒸水１Ｌ）的容器内，用Ｄ－Ｈａｎｋ＇ｓ液洗 脐静脉二次，同前收集洗出液。５００ｇ离心１０ｍｉｎ，弃上清，加１ｍｌ完全培养基使细胞悬 浮、计数，并调整细胞浓度约为５０万个／ｍｌ，接种于２４孔细胞培养板中，每孔０．２５ｍｌ ，置ＣＯ２细胞培养箱（美国ＳＨＩＬＴＯＮ）内培养。２４ｈ后换液一半左右，４８ｈ后吸尽原 培养液，每孔加完全培养基０．８ｍｌ。一般在４ｄ融合生长成片。此时细胞可用于后继实验。培 养细胞在倒置相差显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，日本产）下为梭形或卵石状排列，单层生长，ⅧＲ∶ Ａｇ荧光反应阳性，这些均为内皮细胞生长特征。１．３实验方法融合生长的内皮细胞随机分为４ 组，于完全培养基内分别加入Ｄ－Ｈａｎｋ＇ｓ液（对照组）；ｒｈ－ＴＮＦα（ＴＮＦ组）；益 气活血方（药物组）、ｒｈ－ＴＮＦα和益气活血方（ＴＮＦ＋药物组）各１０μｌ，使ＴＮＦ终 浓度为５００ｕ／ｍｌ、药物终浓度为２０ｍｇ／ｍｌ，置５％ＣＯ２３７℃环境下继续培养。１ ．４制备细胞破碎液２４ｈ后，培养孔中细胞用冷Ｄ－Ｈａｎｋ＇ｓ液洗二遍后，每孔加入１ｍｌ ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，置４℃冰箱过夜，次日收集于ｅｎｐｅｒｄｏｒｆ管，即为细 胞破碎液（Ｃ．Ｅｘｔ），置于－２６℃待测。１．５观察指标１．５．１细胞形态光镜下观察， 经冰醋酸、乙醇固定，苏木素－伊红染色后，在Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜下摄影１．５．２测定Ｃ． Ｅｘｔ中超氧化物歧化酶活性（ＳＯＤＡ）采用邻苯三酚自氧化法。１．５．３测定Ｃ．Ｅｘｔ中 谷胱甘肽过氧化物酶活性（ＧＳＨ－Ｐｘ）采用ＤＴＮＢ直接法。１．５．４测定Ｃ．Ｅｘｔ中脂 质过氧化物含量采用ＴＢＡ荧光分光光度法。以上指标均用ＶＥＣ蛋白含量定量（ｍｇ．ｐｒ）， 蛋白质含量测定采用Ｌｏｗｒｙ法［５］。１．６统计方法采用２×２析因设计方差分析法分析药 物与ＴＮＦ的交互作用及各自的作用。２结果２．１细胞形态正常对照组细胞呈梭形或卵石状紧密 排列生长，染色后胞核形状规则，核膜完整（图１）；而ＴＮＦ组细胞收缩，呈濒死状，染色后核 质致密，核膜皱缩，细胞器减少或消失，细胞之间距离增大（图２），ＴＮＦ＋药物组，细胞形状 介于前两者之间（图３）。图１正常ＨＵＥＣ（伊红－图２ＴＮＦ组ＨＵＥＣ（ＴＮＦ作用图３Ｔ ＮＦ＋药物组ＨＵＥＣ（ＴＮＦ与药物共同苏木素染色，１０×４０）２４ｈ后，伊红－苏木素染 色，１０×４０）作用２４ｈ后，伊红－苏木素染色，１０×４０）２．２细胞内自由基体系指标 如表所示，与空白对照组比较，ＴＮＦ组细胞内超氧化物岐化酶活性显著降低（Ｐ＜０．０１）， 脂质过氧化物含量明显升高（Ｐ＜０．０１），益气活血方虽能对抗ＳＯＤ活性下降和ＬＰＯ升高 ，但统计学处理无显著性意义（Ｐ＞０．０５）。谷胱苷肽过氧化物酶活性在各组之间无显著性差 异（Ｐ＞０．０５）。见附表。附表ＨＵＥＣ内自由基体系指标（ｘ±ｓ）组别ｎＳＯＤ（ｕ／ｍ ｇ．ｐｒ）ＧＳＨ－Ｐｘ（ｕ／ｍｇ．ｐｒ）ＬＰＯ（ｎｍｏｌ／ｍｇ．ｐｒ）空白对照组８２７ ．１６±５．５５３５．０１±９．４０３．５２±０．９５肿瘤坏死因子组（ＴＮＦ）８１６． ３９±５．１９※３０．８８±８．１７５．１２±１．０２※益气活血方组（ＹＱＨＸＦ）８２ ６．２１±６．３１３５．９１±８．８３２．７４±０．９２ＴＮＦ＋ＹＱＨＸＦ组８２２．８ ２±５．９６３２．０８±９．３３４．２８±１．０４注：与空白对照组比较※Ｐ＜０．０１３ 讨论本研究结果显示，重组的人肿瘤坏死因子α在体外能损伤血管内皮细胞，导致内皮细胞收缩， 核质密度增大，甚至细胞破坏，这种损伤作用与自由基有关，表现为氧自由基清除酶即超氧化物岐 化酶活性下降，而过氧化脂质增多。本研究中内皮细胞损伤程度比以往的有关报告更为严重，可能 与肿瘤坏死因子应用的浓度较高有关，如ＲｏｂａｙｅＢ等应用小剂量ＴＮＦ（２００ｕ／ｍｌ） 作用８ｈ后即可诱导培养的牛主动脉内皮细胞发生凋亡［２］，金惠铭等用４００ｕ／ｍｌ的重组 人肿瘤坏死因子作用于人脐静脉内皮细胞７２ｈ后在光镜下见细胞拉长，电镜下细胞表面微绒毛减 少，髓样小体出现，细胞器肿胀，并且发生一系列功能改变［３］。大量研究报道益气活血药在防 治心脑血管血栓性疾病方面具有良好的效果，其重要机制是保护血管内皮细胞、维持其正常的抗血 栓功能，如补阳还五汤可促进凝血酶诱导内皮细胞释放纤溶酶激活物，同时抑制其释放纤溶酶激活 物抑制剂及ｖｏｎＷｉｌｅｂｒａｎｄ因子［６］。本研究显示，益气活血方对肿瘤坏死因子引起 的内皮细胞损伤同样具有作用，一方面维持其形态结构的完整，另一方面调节细胞脂质过氧化以对 抗ＴＮＦ引起的ＶＥＣ损伤，因此益气活血方对抗ＴＮＦ损伤血管内皮细胞极可能通过抗氧化作用 而发挥。本文对内皮细胞损伤程度的研究仅在光镜下进行形态观察，从电镜下探讨其超微结构的变 化，并用特异性较高的指标来衡量是下一步继续深入的工作益气活血方对自由基介导肿瘤坏死因子 损伤血管内皮细胞的影响陈喜容朱惠斌（湖南中医学院基础课部长沙４１０００７）（湖南中医学 院附属第一医院益气活血方,自由基,肿瘤坏死因子,血管内皮细胞以体外原代培养的人脐静脉内 皮细胞（ＨＵＥＣ）为试验对照，观察肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）作用于ＨＵＥＣ后，细胞形态及细 胞内超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）和脂质过氧化物（ＬＰＯ ）的变化及中药益气活血方的作用。结果显示：与空白对照组比较，ＴＮＦ组细胞内ＳＯＤ活性下 降而ＬＰＯ含量升高（Ｐ＜０．０１），细胞收缩，核质密度增大，益气活血方（２０ｍｇ／ｍｌ ）能抑制ＴＮＦ引起的ＳＯＤ活性下降和ＬＰＯ含量升高（Ｐ＞０．０５），并保护其形态的过度 改变，提示抗脂质过氧化可能是益气活血方抗ＴＮＦ损伤血管内皮细胞的重要机制。１Ｍａｔｈｅ ｗｓＮ．Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｆｒｏｍｔｈｅｒａｂｂｉｔ．Ⅱ．Ｐｒｏｄ ｕｃ－ｔｉｏｎｂｙｍｏｎｏｃｙｔｅ．ＢｒＪｃａｎｃｅｒ１９７８，３８：３１０２Ｒｏｂａ ｙｅ．Ｂ，ＭｏｓｓｅｌｍａｎｓＲ，ＦｉｅｒｓＷ．ｅｔａｌ．Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆ ａｃ－ｔｏｒｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｄｅａｔｈ）ｉ ｎｎｏｒｍａｌｅｎｄｏｔｈｅ－ｌｉａｌｃｅｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＡｍＪｐａｔｈｏｌ．１９ ９１，１３８：４４７３金惠铭，沙志一，刘信桥．ＴＮＦα引起内皮细胞损伤与ｃ－ｊｕｎ、ｃ －ｆｏｓ基因表达改变的关系．中国病理生理杂志，１９９６，（１２）：５４１４ＪａｆｅＥＡ ，ＮａｃｈｍａｎＲＬ，ＢｅｃｋｅｒＣＧ，ｅｔａｌ．Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎｃｅｌｄ ｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｕｎｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｓＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１９７３，５２： ２７４５５徐叔云，卞如廉，陈修主编．药理实验方法学·第２版，北京：人民卫生出版社，１９ ９１．４９０６姚龙彪，李安国，贺石林，等．补阳还五汤对凝血酶诱导血管内皮细胞释放反应的 影响．中国中西医结合杂志，１９９３，特集：７０湖南省自然科学基金２±１．０２※益气活血 方组（ＹＱＨＸＦ）８２６．２１±６．３１３５．９１±８．８３２．７４±０．９２ＴＮＦ＋ ＹＱＨＸＦ组８２２．８２±５．９６３２．０８±９．３３４．２８±１．０４注：与空白对照 组比较※Ｐ＜０．０１３讨论本研究结果显示，重组的人肿瘤坏死因子α在体外能损伤血管内皮细 胞，导致内皮细胞收缩，核质密度增大，甚至细胞破坏，这种损伤作用与自由基有关，表现为氧自 由基清除酶即超氧化物岐化酶活性下降，而过氧化脂质增多。本研究中内皮细胞损伤程度比以往的 有关报告更为严重，可能与肿瘤坏死因子应用的浓度较高有关，如ＲｏｂａｙｅＢ等应用小剂量Ｔ ＮＦ（２００ｕ／ｍｌ）作用８ｈ后即可诱导培养的牛主动脉内皮细胞发生凋亡［２］，金惠铭等用４００ｕ／ｍｌ的重组人肿瘤坏死因子作用于人脐静脉内皮细胞７２ｈ后在光镜下见细胞拉长，电镜下细胞表面微绒毛减少，髓样小体出现，细胞器肿胀，并且发生一系列功能改变［３］。大量研究报道益气活血药在防治心脑血管血栓性疾病方面具有良好的效果，其重要机制是保护血管内皮
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