以往研究发现，肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）对血管内皮细 胞具有损伤作用［１，２］，且与自由基损伤有一定的相关性［３］。本研究旨在从血管内皮细胞 释放反应的角度探讨ＴＮＦ的作用及中药益气活血方的影响。１材料与方法１．１主要药品与试剂 益气活血方：由黄芪、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙、僵蚕、蒲黄等药物组成，采用水煎醇沉法 制成注射剂，ｐＨ值７．２，离子强度０．０５，每毫升含生药量２ｇ。重组人肿瘤坏死因子α（ ｒｈ－ＴＮＦα）：北京邦定生物医学公司产品，批号：９６０６１８；ＲＰＭＩ１６４０培养基 干粉：ＪＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司产品；ＨＥＰＥＳ：Ｇｉｂｃｏ公司产品；胰蛋白酶（Ｔｒ ｙｐｓｉｎ）：Ｄｉｆｃｏ公司产品；小牛血清：杭州四季青生物材料研究所产品；２４孔细胞培 养板：Ｎｕｎｃｌｏｎ，丹麦产；新鲜胎儿脐带：由湖南省妇幼保健院产科提供。１．２内皮细胞 培养参照Ｊａｆｅ等建立的方法［４］。细胞在倒置相差显微镜（０ｌｙｍｐｕｓ，日本产）下为 梭形或卵石状排列，单层生长，ⅧＲ：Ａｇ荧光反应阳性，这些均为内皮细胞生长特征。１．３实 验方法融合生长的内皮细胞随机分为４组，于完全培养基内分别加入Ｄ－Ｈａｎｋ＇ｓ液（空白对 照组）、ｒｈ－ＴＮＦα（ＴＮＦ组）、益气活血方（药物组）、ｒｈ－ＴＮＦα和益气活血方（ ＴＮＦ＋药物组）各１０μｌ，使ＴＮＦ终浓度为５００ｕ／ｍｌ、药物终浓度为２０ｍｇ／ｍｌ ，置ＣＯ２细胞培养箱继续培养。１．４制备条件培养液分别于８ｈ和２４ｈ收集细胞培养液，４ ℃、３０００ｒｌｍｉｎ离心１０ｍｉｎ以去除悬浮死亡细胞。离心后培养液即为条件培养液，－ ２６℃冷冻待测。１．５观察指标６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α和ＴＸＢ２采用放射免疫法测定。测 试药盒由苏州医学院血栓研究室提供，操作方法按使用说明书。１．６统计学方法采用２×２析因 设计方差分析法分析药物与ＴＮＦ的交互作用及各自作用。２结果２．１益气活血方与ＴＮＦ作用 于ＨＵＥＣ８ｈ后６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、ＴＸＢ２及Ｔ／Ｋ比值的变化与空白对照组比较， ＴＮＦ组６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α显著增多而ＴＸＢ２明显减少（Ｐ＜０．０１），Ｔ／Ｋ比值 显著下降（Ｐ＜０．０１）；益气活血方单独作用不明显（Ｐ＞０．０５），但能协同ＴＮＦ诱导 ６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α增多，对ＴＮＦ引起的ＴＸＢ２及Ｔ／Ｋ比值下降具有显著的拮抗作用 （Ｐ＜０．０１），见表１所示。表１作用８小时后６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、ＴＸＢ２及Ｔ／ Ｋ比值的变化（ｘ±ｓ，ｐｇ／ｍｌ）组别ｎ６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１αＴＸＢ２Ｔ／Ｋ比值空白 对照组８２４６．１３±２３．５８１４４６．２４±１５２．５１５．９２±０．９９ＴＮＦ组 ８４０９．７５±２８．７１＃９７０．２６±１６８．６６＃２．３７±０．２１＃药物组８２ ９４．３８±２０．７３１４０７．２０±１４４．７３４．７９±０．４８ＴＮＦ＋药物组８４ ９２．２５±３３．０４※１４８３．１４±１６２．９９※※３．０３±０．３６※※＃表示与 空白对照组比较Ｐ＜０．０１；益气活血方与ＴＮＦ交互作用：※表示Ｐ＜０．０５，※※表示Ｐ ＜０．０１２．２益气活血方与ＴＮＦ作用于ＨＵＥＣ２４ｈ后６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、ＴＸ Ｂ２及Ｔ／Ｋ比值的变化作用２４ｈ后，与空白对照组比较，ＴＮＦ组条件培养液中６－ｋｅｔｏ －ＰＧＦ１α继续增多（Ｐ＜０．０１），ＴＸＢ２无明显差异（Ｐ＞０．０５），但Ｔ／Ｋ比值 显著下降（Ｐ＜０．０１）；药物组各指标变化无显著性意义（Ｐ＞０．０５），但药物对ＴＮＦ 引起的６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α升高有协同作用（Ｐ＜０．０１）；药物对ＴＸＢ２变化及Ｔ／ Ｋ比值下降的拮抗作用消失，见表２。表２作用２４小时后６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、ＴＸＢ２ 及Ｔ／Ｋ比值的变化（ｘ±ｓ，ｐｇ／ｍｌ）组别ｎ６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１αＴＸＢ２Ｔ／Ｋ比 值空白对照组８３６８．００±３７．９５１６９１．５４±１５４．４７４．６６±０．７９Ｔ ＮＦ组８６１４．１３±５０．７５＃１５８７．１０±１５０．２７２．６０±０．３８＃药物 组８３５９．３８±４４．８８１７０２．０３±１７０．８９４．８４±１．０２ＴＮＦ＋药物 组８８４１．２５±６５．９６※１７５７．４４±２２５．８５２．１２±０．４３＃表示与空 白对照组比较Ｐ＜０．０１；※表示益气活血方与ＴＮＦ交互作用，Ｐ＜０．０１３讨论６－ｋｅ ｔｏ－ＰＧＦ１α是前列环素（ＰＧＩ２）的代谢产物。ＰＧＩ２主要由血管内皮细胞分泌，具有 抑制血小板粘附、聚集，扩张血管以及使小血管通透性增大等作用。本研究结果表明，ＴＮＦ在８ 小时和２４小时两个时相均能显著促进ＨＵＥＣ释放ＰＧＩ２，这是ＴＮＦ作为炎症介质引起小血 管通透性增加的重要机制之一［５］。ＴＸＢ２是ＴＸＡ２的代谢产物，主要由血小板释放，具有 促进血小板粘附、聚集和收缩血管的作用。在体内，ＰＧＩ２和ＴＸＡ２是一对动态平衡物质，共 同调节着血管的舒缩和血小板功能。ＴＸＡ２亦可由ＨＵＥＣ合成、释放，与ＰＧＩ２共同维持Ｈ ＵＥＣ的正常功能。本研究结果发现，ＴＮＦ作用内皮细胞８小时后ＴＸＡ２释放明显受到抑制， 而２４小时后这种抑制作用被解除，表明ＴＮＦ在８小时对ＨＵＥＣ的作用尤为明显。以往研究发 现，中药益气活血方能明显对抗ＴＮＦ对ＨＵＥＣ的损伤作用，通过提高自由基清除酶活性而维持 ＨＵＥＣ的正常形态［３］。本研究发现，在８小时后益气活血方能明显对抗ＴＮＦ抑制ＨＵＥＣ 释放ＴＸＡ２，从而对抗Ｔ／Ｋ比值的下降，表明益气活血方能抑制ＴＮＦ引起的炎性血管通透性 增加。２４小时后益气活血方能继续促进ＰＧＩ２的释放而对ＴＸＡ２的影响消失，其可能原因是 ＨＵＥＣ释放ＴＸＡ２达到饱和。益气活血方对ＰＧＩ２释放的持续作用亦可能是其抗血栓机制之 一。益气活血方对肿瘤坏死因子诱导血管内皮细胞释放反应的影响@葛金文@朱惠斌@彭延古@喻 嵘@邓奕辉$湖南中医学院科技处益气活血方,肿瘤坏死因子,前列环素,血栓烷Ａ_２以体外原 代培养的人脐静脉内皮细胞（ＨＵＥＣ）为受试对象，观察肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）作用于ＨＵＥ Ｃ后不同时相条件培养液中６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α和血栓烷Ｂ２（ＴＸＢ２）含量的变化及中 药益气活血方的作用。结果显示：作用８小时后，ＴＮＦ组６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α显著升高， 而ＴＸＢ２明显下降（Ｐ＜０．０１），Ｔ／Ｋ比值明显下降（Ｐ＜０．０１），益气活血方对６ －ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α升高具有协同作用（Ｐ＜０．０１），对ＴＸＢ２及Ｔ／Ｋ比值下降具有 拮抗作用（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）；２４小时后，ＴＮＦ组６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α显 著升高（Ｐ＜０．０１），ＴＸＢ２无明显变化（Ｐ＞０．０５），Ｔ／Ｋ比值明显下降（Ｐ＜０ ．０１），益气活血方对６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α升高具有协同作用（Ｐ＜０．０１），但对Ｔ ＸＢ２及Ｔ／Ｋ比值下降无明显影响（Ｐ＞０．０５）。提示ＴＮＦ作为炎症介质能导致血管扩张 、管壁通透性增大，而益气活血方在一定时间内具有对抗作用。１ＭａｔｈｅｗｓＮ．Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｆｒｏｍｔｈｅｒａｂｂｉｔ．Ⅱ．Ｐｒｏｄｕｃ－ｔｉｏｎｂｙ ｍｏｎｏｃｙｔｅ．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ１９７８，３８：３１０２ＲｏｂａｙｅＢ，Ｍｏｓｓｅ ｌｍａｎｓＲ，ＦｉｅｒｓＷ，ｅｔａｌ．Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｉｎｄｕｃ ｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｄｅａｔｈ）ｉｎｎｏｒｍａｌｅｎｄｏ ｔｈｅｌｉａｌ－ｃｅｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＡｍＪＰａｔｈｏｌ．１９９１，１３８：４４７３ 金惠铭，沙志一，刘信桥．ＴＮＦα引起内皮细胞损伤与ｃ－ｊｕｎ、ｃ－ｆｏｓ基因表达改变的 关系．中国病理生理杂志，１９９６，（１２）：５４１４ＪａｆｅＥＡ，ＮａｃｈｍａｎＲＬ， ＢｅｃｋｅｒＣＧ，ｅｔａｌ．Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎｃｅｌｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｕ ｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｓ．ＪＣｌｉｎｌｎｖｅｓｔ１９７３，５２：２７４５５Ｄａｖｉｄ ｓｏｎＥＭ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ（ＰＧｌ２）：Ａｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｄ ｉａｔｏｒｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．ＢｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ１９７８，６４：４３７ 湖南省自然科学基金内，ＰＧＩ２和ＴＸＡ２是一对动态平衡物质，共同调节着血管的舒缩和血小 板功能。ＴＸＡ２亦可由ＨＵＥＣ合成、释放，与ＰＧＩ２共同维持ＨＵＥＣ的正常功能。本研究 结果发现，ＴＮＦ作用内皮细胞８小时后ＴＸＡ２释放明显受到抑制，而２４小时后这种抑制作用 被解除，表明ＴＮＦ在８小时对ＨＵＥＣ的作用尤为明显。以往研究发现，中药益气活血方能明显 对抗ＴＮＦ对ＨＵＥＣ的损伤作用，通过提高自由基清除酶活性而维持ＨＵＥＣ的正常形态［３］ 。本研究发现，在８小时后益气活血方能明显对抗ＴＮＦ抑制ＨＵＥＣ释放ＴＸＡ２，从而对抗Ｔ ／Ｋ比值的下降，表明益气活血方能抑制ＴＮＦ引起的炎性血管通透性增加。２４小时后益气活血 方能继续促进ＰＧＩ２的释放而对ＴＸＡ２的影响消失，其可能原因是ＨＵＥＣ释放ＴＸＡ２达到 饱和。益气活血方对ＰＧＩ２释放的持续作用亦可能是其抗血栓机制之一。益气活血方对肿瘤坏死 因子诱导血管内皮细胞释放反应的影响@葛金文@朱惠斌@彭延古@喻嵘@邓奕辉$湖南中医学院 科技处益气活血方,肿瘤坏死因子,前列环素,血栓烷Ａ_２以体外原代培养的人脐静脉内皮细胞 （ＨＵＥＣ）为受试对象，观察肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）作用于ＨＵＥＣ后不同时相条件培养液中６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α和血栓烷Ｂ２（ＴＸＢ２）含量的变化及中药益气活血方的作用。结果显示：作用８小时后，ＴＮＦ组６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α显著升高，而ＴＸＢ２明显下降（Ｐ＜０．０１），Ｔ／Ｋ比值明显下降（Ｐ＜０．０１），益气活血方对６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α升
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