应用试剂盒检测中药材及中成药黄曲霉毒素B_1

应用试剂盒检测中药材及中成药黄曲霉毒素Ｂ１河南省药品检验所４５０００３任凤兰马宏伟中药采 集后不及时干燥或贮存不当或在制备和加工过程中处理不善，可能污染各种霉菌并产生霉菌毒素， 其中黄曲霉素Ｂ１（以下称ＡＦＢ１）毒性最大，致癌力最强．为保证人民用药安全有效，我们进 行了中药污染ＡＦＢ１的含量测定方法的研究．应用间接竞争酶联免疫吸附法，采用标准化试剂盒 ，通过对５５批不同品种的中药材及含豆豉、曲类的中药制剂污染ＡＦＢ１的含量测定，检出含Ａ ＦＢ１的中药５３批，检出率为９６％．表明中药污染ＡＦＢ１的情况较严重，为控制中药质量， 制定药品卫生标准提供数据及科学的检测方法，十分必要．１仪器与试剂ＤＧ—３０２２Ａ型酶联 免疫测定仪（华东电子管厂）；微量移液器（上海求精生化试剂仪器有限公司），电热三用水箱（ 北京医疗设备厂）；７５—２型微量搅拌器（上海医用分析仪器厂）；ＡＦＢ１（ＥＬＩＳＡ）检 测试剂盒（北京赛蒂克生物技术有限公司），其组成：①ＡＦＢ１标准系列：浓度为５０、２０、 １０、５、１、０μｇ／Ｌ用前混匀（０μｇ／Ｌ即为阴性对照）；②ＡＦＢ１—Ⅰ抗一瓶；③酶 标Ⅱ抗一瓶；④显色片及ＯＰＤ各４片．临用前１０～１５ｍｉｎ取显色片和ＯＰＤ各１片溶于１ ０ｍＬ蒸馏水（避光操作）；⑤终止液一瓶；⑥已包被固相抗原的酶标板一块（４８孔／块）．其 中Ａ１～Ａ１２未包被抗原，为空白对照孔；⑦ＰＢＳ—Ｔ片３片，２００ｍＬ／片（即１片溶于 ２００ｍＬ蒸馏水中）．２样品中药材３０批及中成药５个品种不同批号２５批，均为市售品．３ 原理将固相ＡＦＢ１复合抗原预先包被在酶标板上，使用时加入抗ＡＦＢ１抗体和样品提取液，使 固相抗原和样品提取液中的ＡＦＢ１竞争性地与ＡＦＢ１抗体结合，然后加入酶标Ⅱ抗，经充分反 应后，加入显色液，所显颜色的深浅与样品提取液中的ＡＦＢ１含量成反比．４标准曲线的制备加 入一系列ＡＦＢ１标准溶液浓度（１～２０μｇ／Ｌ），每个浓度平行加２孔，每孔２５μＬ，随 即加入ＡＦＢ１—Ⅰ抗２５μＬ，将酶标板放置在微量搅拌器上振摇２ｍｉｎ使孔内液体混匀，置 ３７℃恒温水箱避光温育１．５ｈ，将板取出甩干，每孔加满洗涤液，放置４ｍｉｎ甩干，重复洗 涤３次，拍干（上述操作尽量避光），同时设空白对照孔和阴性对照孔．加入酶标Ⅱ抗５０μＬ， 置３７℃温育１ｈ，同上洗涤３次，拍干．加显色液５０μＬ，避光置３７℃温育５ｍｉｎ左右． 加入终止液５０μＬ，终止反应．立即同酶标仪（ＤＧ—３０２２Ａ型酶联免疫测定仪）在４９０ ｎｍ波长处测定各孔的吸收度（Ａ）．计算结果表明浓度在１～２０μｇ／Ｌ之间与测得的吸收度 呈直线关系．回归方程为：Ｙ＝－０．０７Ｘ＋１．９６ｒ＝０．９９９５样品测定取中药材或中 成药样品各１０ｇ，分别加含７０％甲醇ＰＢＳ—Ｔ缓冲液５０ｍＬ，振摇２ｍｉｎ（约１２０次 ），室温下静置１０ｍｉｎ．将上清液（约１～２ｍＬ）过滤，置４℃冰箱过夜．取１００μＬ上 清液加入盛有９００μＬＰＢＳ—Ｔ的试管中混匀．测定方法与制作标准曲线步骤相同．根据样品 孔的吸收度在标准曲线上查出相应的ＡＦＢ１含量，并根据样品稀释倍数计算出样品中的ＡＦＢ１ 含量，测定结果见表１．表１３０种中药材及２５批中药丸剂ＡＦＢ１含量检测结果（ｎｇ／ｇ） 品名ＡＦＢ１含量品名ＡＦＢ１含量佛手２９３．５陈皮７２４．５灸冬花７１．０土茯苓５９５ ．０白蔻０．０保和丸（９６０３０３）５５２．５远志４４８．５保和丸（９４０８０５）５５ ０．５白术２５８．０保和丸（９６０４０８）４３５．０潘泻叶６５８．０保和丸（９６０３０ ８—９）６８５．５麦冬１８．０保和丸（９６０３０９）２８８．５枸杞子０．０山楂丸（９４ １１０５）８０１．０胖大海３７１．０山楂丸（９５１１０６）３５５．５青皮５０９．０山楂 丸（９６０６０１）３８０．５神曲５７８．０山楂丸（９６０４０３）２９３．５木瓜６１２． ５山楂丸（９５１１０７）５１６．５白芍７０７．５柏子养心丸（９５１１０５）６２７．０芦 根６６４．５柏子养心丸（９４０９３８）６３５．０三棱２５０．０柏子养心丸（９４０９２３ ）６８０．０合欢皮２８８．５柏子养心丸（９６０６１０）６５５．０菊花７１３．０柏子养心 丸（９４１００４）２５０．０黄芪３２７．０银翘解毒丸（９４０７０９）６１５．５当归３７ ２．５银翘解毒丸（９５０５０２）７９１．０杏仁４０．５银翘解毒丸（９６０３０３）６２３ ．０豆豉３６０．０银翘解毒丸（９６０３０６）６７８．０泽泻２５７．５银翘解毒丸（９４０ ４０１）８１９．０柏子仁２７０．５沉香化滞丸（９６０６０２）８３３．０五味子５２６．０ 沉香化滞丸（９６０６０４）８３３．５山芋肉２８３．０沉香化滞丸（９６０６０３）８２２． ０薄荷４２２．０沉香化滞丸（９６０６０５）７５０．０丹参９０５．５沉香化滞丸（９６０６ ０１）８７８．０桂枝８９４．０注：括号内数字为该样品批号６讨论６．１由于本法是微量测定 ，使用标准化试剂盒，可以减少配制试液稀释过程中人为的操作误差，使实验操作更简便、规范． ６．２样品提取液在４℃冰箱放置过夜，可将提取液内固态悬浮物质沉淀出来，减少了干扰因素， 以提高实验精度．６．３通过对３０批不同品种的中药材及不同批号的２５批含豆豉、曲类的中药 制剂中ＡＦＢ１的含量检测，已显示出中药污染ＡＦＢ１的严重性，中药材丹参、桂枝、陈皮、菊 花、白芍等ＡＦＢ１含量均在７００ｎｇ／ｇ以上，沉香化滞丸、银翘解毒丸、柏子养心丸的ＡＦ Ｂ１含量均在６００ｎｇ／ｇ以上．中成药中ＡＦＢ１含量较高可能与该品种中含有易霉变的神曲 、豆豉、柏子仁等有关．故加强药材的管理，方可防止中药霉变及黄曲霉毒素污染．６．４有关部 门应重视中药中黄曲霉毒素的污染，组织力量调研，积累数据，尽早制定中药ＡＦＢ１的限度标准 ，以保证药品卫生质量．应用试剂盒检测中药材及中成药黄曲霉毒素B_1$河南省药品检验所@ 任凤兰@马宏伟字为该样品批号６讨论６．１由于本法是微量测定，使用标准化试剂盒，可以减少 配制试液稀释过程中人为的操作误差，使实验操作更简便、规范．６．２样品提取液在４℃冰箱放 置过夜，可将提取液内固态悬浮物质沉淀出来，减少了干扰因素，以提高实验精度．６．３通过对 ３０批不同品种的中药材及不同批号的２５批含豆豉、曲类的中药制剂中ＡＦＢ１的含量检测，已 显示出中药污染ＡＦＢ１的严重性，中药材丹参、桂枝、陈皮、菊花、白芍等ＡＦＢ１含量均在７ ００ｎｇ／ｇ以上，沉香化滞丸、银翘解毒丸、柏子养心丸的ＡＦＢ１含量均在６００ｎｇ／ｇ以 上．中成药中ＡＦＢ１含量较高可能与该品种中含有易霉变的神曲、豆豉、柏子仁等有关．故加强 药材的管理，方可防止中药霉变及黄曲霉毒素污染．６．４有关部门应重视中药中黄曲霉毒素的污染，组织力量调研，积累数据，尽早制定中药ＡＦＢ１的限度标准，以保证药品卫生质量．应用试剂盒检测中药材及中成药黄曲霉毒素B_1$河南省药品检验所@任凤兰@马宏伟