铁皮石斛种子的超低温保存研究☆张治国刘骅夏志俊王君晖(浙江省医学科学院药物研究所杭州3 10013)提要:研究影响铁皮石斛种子超低温保存的一些主要因素:
种子含水量、解冻方法、 恢复生长方法、保存时间等。结果表明,含水量是超低温保存的主要因素,种子含水量降到8%~ 18%,直接投入液氮中,经保存后,40℃水浴上快速解冻,种子萌发率为92%~95%,与 未经冷冻的种子的萌发率一致,并生长成正常植株。关键词:
铁皮石斛;种子;超低温保存;液氮 中图法分类号:R282.4铁皮石斛为我国名贵中药,长期来由于无节制的采挖,加之其自然繁 殖率很低,资源枯竭,列为国家保护的野生药材品种。为保护这一珍贵种质资源,加速繁殖,扩大 栽培,试管繁殖已获得成功〔1~3〕。试管繁殖以种子为繁殖材料,但采集铁皮石斛果实时间性 强,采摘方法困难,这给种子的及时供应带来困难。同时野生资源面临绝迹的危险。研究铁皮石斛 超低温保存技术,对于保存种质资源,扩大繁殖,都有重要意义。1材料与方法1.1供试材料铁 皮石斛(DendrobiumcandidumWal.exLindl.)果实,于10月 份采于浙江山区悬崖峭壁上。1.2种子含水量测定种子含水量用水份占其鲜重的百分率表示。用 精密天平称重,3个重复。1.3种子的脱水处理将果实消毒后,取出种子置培养皿中无菌滤纸上 ,每一培养皿中放20g变色硅胶。脱水时间分别为3、4、5、6、24、48、72、96h 。1.4冰冻和解冻将脱水后的种子,密封于冷冻管中,直接投入液氮中保存。种子保存24h或 1个月后取出,分别在40℃水浴1min,或室温(20℃,30min)解冻。1.5再培养 试验将解冻后的种子置于1/2MS无激素的培养基上,于培养室中培养,一组直接放光下培养, 另一组先在黑暗中培养1周,再转入光下培养。待原球茎分化形成几片真叶时,再转入1/2MS 并附加香蕉提取液的培养基中诱导成苗。2结果与讨论2.1铁皮石斛种子的抗脱水性能铁皮石斛 一般5月开花,授粉后形成蒴果。其种子极小,一个蒴果内有几万粒种子,发育正常的种子,近似 于橄榄形,种皮为一层透明的薄壁细胞,中间有一个球形的胚,胚的细胞数目,大约保持在90多 个细胞。种龄为4、5、6个月的种子接种在培养基上,萌发率达95%,种子萌发后形成原球茎 ,原球茎可直接发育成幼苗〔4〕。铁皮石斛种子数量大,体积小,实际上是一个胚,含水量较低 ,为41.12%,同时抗脱水性能好,当含水量降到8.21%时,萌发率与未脱水的种子萌发 率相似(表1)。这对于超低温保存是一个有利因素。2.2种子含水量对冷冻保存的影响植物细 胞含水量过高,在冷冻过程中,细胞内易形成冰晶,使细胞膜受损,导致细胞死亡。因此,在冷冻 前细胞必须干燥脱水,使含水量降低到一定范围。该试验中用定量变色硅胶脱水,不同脱水时间的 种子都能萌发。当含水量下降到8.21%~18.79%,冷冻后萌发率与正常种子没有明显差 别(表2)。表1种子含水量对萌发率的影响脱水时间(h)含水量(%)萌发率(%)041. 1294.302428.5093.124818.7995.517212.0594.47 968.2194.34表2种子含水量对冷冻保存的影响含水量(%)萌发率(%)41.12 028.5018.6918.7992.3412.0592.938.2194.062.3 解冻方法对种子萌发率的影响采用两种方法解冻,试验结果表明,在室温(20℃)下慢速化冻和 40℃水浴上快速化冻,种子的萌发率是一致的(表3)。大量实验证实,植物冻害发生在冰冻和 化冻两个过程中,为了在化冻时防止细胞内次生结冰,需要采用快速化冻方法,即在35~40℃ 温度下化冻。于是铁皮石斛种子经超低温冷冻后,采用40℃下快速解冻。表3解冻方法对种子萌 发率的影响含水量(%)萌发率(%)40℃(1min)20℃(30min)28.5018 .6919.4818.7992.3495.2812.0592.9395.508.219 4.0693.502.4再培养方法对种子萌发率的影响将冷冻后的铁皮石斛种子转移到1/2 MS培养基上,分为2组,一组直接放在光下培养;另一组,先在黑暗中培养1周,再转入光下培 养。这2组种子的萌发率差异不明显。用干燥脱水24h种子试验,直接在光下培养萌发率为16 .61%,先黑暗培养,再转入光下者为18.26%。这与甘蔗等培养物超低温保存后再培养的 试验结果不同,甘蔗等培养物培养于黑暗条件下能较快地恢复生长,尔后生长速度也较快,存活率 也较高〔5〕。2.5超低温保存时间对种子萌发率的影响经24h干燥脱水的种子,在液氮中保 存24h或1个月的试验表明,前者的萌发率为18.26%,后者为18.10%。二者基本一 致。这说明种子在液氮中可长期保存。2.6超低温保存后种子的萌发与成苗超低温保存的种子萌 发有一个滞后期,比正常种子萌发延迟7~10天。但萌发后的种子的发育过程与未经超低温保存 的种子一样,在1/2MS培养基上,先萌发成原球茎,原球茎长出2~3片真叶后,转入附加香 蕉提取液的培养基上,可形成完整的植球。3结语干冻法是一种简便高效的超低温保存方法。只要 选择的材料合适,脱水的程度是一个关键。使材料脱水到一个适宜的含水量范围。一些花粉采用此 法都获得成功〔6~9〕。铁皮石斛种子抗脱水性强,当种子含水量控制在8%~18%,其萌发 率与未经冷冻的种子相似,并形成正常植株。这一实验结果,为铁皮石斛种质的长期保存提供了新 的途径。为珍稀濒危药用植物种质库的建立提供科学依据。参考文献1刘瑞驹,蒙爱东,邓锡青, 等.铁皮石斛试管苗快速繁殖的研究.药学学报,1988;23:6362张治国,刘骅,王黎 ,等.铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究.中草药,1992;23:4313张治国,王黎, 刘骅,等.铁皮石斛原球茎分化适宜培养基研究.中国中药杂志,1993;18:164叶秀米 舛,程式君,王伏雄,等.黑节草未成熟种子的形态发育及其在离体培养时的表现.云南植物研究 ,1988;10:1855孙敬三,桂耀林主编.植物细胞工程实验技术.北京:科学出版社, 1995:3186江雨生,高铸九.桃、梨花粉的超低温(-196℃)贮藏.上海农业学报, 1989;5:17石思信,田王月.超低温(-196℃)中保存一年的黑麦花粉生活力.植物 生理学报,1989;15:3938陈品良,贺善安,金炜.杜仲、秤锤树花粉的超低温贮藏研 究.植物学报,1990;32:2889陈霜莹,常永健,赵艳华,等.果树花粉的超低温保存 .华北农学报,1993;8(增刊):60CRYOPRESERVATIONOFSEEDS OFDENDROBIUMCANDIDUMZhangZhiguoLiuHuaXiaZhi junWangJunhui(ZhejiangAcademyofMedicalScien ces,Hangzhou,310013)ABSTRACT:Dendrobiumcand idumisoneofpreciouserareandthreatenedmedici nalplants.Itsgermplastpreservationisveryimp ortantforresourcepreservationandmascultivat ion.Theefectsofseedwatercontent,thawingmeth ods,subculturemethods,storagetimeongerminat ionrateofseedsstoredinliquidnitrogen(LN)wer estudied.Theresultsshowedthatseedwaterconte ntiskeyfactorforcryopreservationinLN.Thesee dsweredriedtowatercontent8%~18%beforebeingp utintoLNforaperiodoftime,andthenthawedin40℃ waterbathfor1minute.Thegerminationrateofsee dsreached92%~95%.SedsstoredinLNcouldnormaly formedplantletsinsuitableculturemedium.KEYW ORDS:Dendrobiumcandidum;Seeds;Cryopreservat ion;Liquidnitrogen铁皮石斛种子的超低温保存研究@张治国@刘骅@夏志俊 @王君晖$浙江省医学科学院药物研究所$杭州大学生命科学院铁皮石斛;种子;超低温保存;液 氮研究影响铁皮石斛种子超低温保存的一些主要因素:种子含水量、解冻方法、恢复生长方法、保 存时间等。结果表明,含水量是超低温保存的主要因素,种子含水量降到8%~18%,直接投入 液氮中,经保存后,40℃水浴上快速解冻,种子萌发率为92%~95%,与未经冷冻的种子的 萌发率一致,并生长成正常植株。1刘瑞驹,蒙爱东,邓锡青,等.铁皮石斛试管苗快速繁殖的研 究.药学学报,1988;23:6362张治国,刘骅,王黎,等.铁皮石斛原球茎增殖的培养 条件研究.中草药,1992;23:4313张治国,王黎,刘骅,等.铁皮石斛原球茎分化适 宜培养基研究.中国中药杂志,1993;18:164叶秀米舛,程式君,王伏雄,等.黑节草 未成熟种子的形态发育及其在离体培养时的表现.云南植物研究,1988;10:1855孙敬三,桂耀林主编.植物细胞工程实验技术.北京:科学出版社,1995:3186江雨生,高铸九.桃、梨花粉的超低温(-196℃)贮藏.上海农业学报,1989;5:17石思信,田王月.超低温(-196℃)中保存一年的黑麦花粉生活力.植物生理学报,1989;15:39
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