铁皮石斛种子的超低温保存研究☆张治国刘骅夏志俊王君晖（浙江省医学科学院药物研究所杭州３ １００１３）提要：研究影响铁皮石斛种子超低温保存的一些主要因素：
种子含水量、解冻方法、 恢复生长方法、保存时间等。结果表明，含水量是超低温保存的主要因素，种子含水量降到８％～ １８％，直接投入液氮中，经保存后，４０℃水浴上快速解冻，种子萌发率为９２％～９５％，与 未经冷冻的种子的萌发率一致，并生长成正常植株。关键词：
铁皮石斛；种子；超低温保存；液氮 中图法分类号：Ｒ２８２．４铁皮石斛为我国名贵中药，长期来由于无节制的采挖，加之其自然繁 殖率很低，资源枯竭，列为国家保护的野生药材品种。为保护这一珍贵种质资源，加速繁殖，扩大 栽培，试管繁殖已获得成功〔１～３〕。试管繁殖以种子为繁殖材料，但采集铁皮石斛果实时间性 强，采摘方法困难，这给种子的及时供应带来困难。同时野生资源面临绝迹的危险。研究铁皮石斛 超低温保存技术，对于保存种质资源，扩大繁殖，都有重要意义。１材料与方法１．１供试材料铁 皮石斛（ＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｃａｎｄｉｄｕｍＷａｌ．ｅｘＬｉｎｄｌ．）果实，于１０月 份采于浙江山区悬崖峭壁上。１．２种子含水量测定种子含水量用水份占其鲜重的百分率表示。用 精密天平称重，３个重复。１．３种子的脱水处理将果实消毒后，取出种子置培养皿中无菌滤纸上 ，每一培养皿中放２０ｇ变色硅胶。脱水时间分别为３、４、５、６、２４、４８、７２、９６ｈ 。１．４冰冻和解冻将脱水后的种子，密封于冷冻管中，直接投入液氮中保存。种子保存２４ｈ或 １个月后取出，分别在４０℃水浴１ｍｉｎ，或室温（２０℃，３０ｍｉｎ）解冻。１．５再培养 试验将解冻后的种子置于１／２ＭＳ无激素的培养基上，于培养室中培养，一组直接放光下培养， 另一组先在黑暗中培养１周，再转入光下培养。待原球茎分化形成几片真叶时，再转入１／２ＭＳ 并附加香蕉提取液的培养基中诱导成苗。２结果与讨论２．１铁皮石斛种子的抗脱水性能铁皮石斛 一般５月开花，授粉后形成蒴果。其种子极小，一个蒴果内有几万粒种子，发育正常的种子，近似 于橄榄形，种皮为一层透明的薄壁细胞，中间有一个球形的胚，胚的细胞数目，大约保持在９０多 个细胞。种龄为４、５、６个月的种子接种在培养基上，萌发率达９５％，种子萌发后形成原球茎 ，原球茎可直接发育成幼苗〔４〕。铁皮石斛种子数量大，体积小，实际上是一个胚，含水量较低 ，为４１．１２％，同时抗脱水性能好，当含水量降到８．２１％时，萌发率与未脱水的种子萌发 率相似（表１）。这对于超低温保存是一个有利因素。２．２种子含水量对冷冻保存的影响植物细 胞含水量过高，在冷冻过程中，细胞内易形成冰晶，使细胞膜受损，导致细胞死亡。因此，在冷冻 前细胞必须干燥脱水，使含水量降低到一定范围。该试验中用定量变色硅胶脱水，不同脱水时间的 种子都能萌发。当含水量下降到８．２１％～１８．７９％，冷冻后萌发率与正常种子没有明显差 别（表２）。表１种子含水量对萌发率的影响脱水时间（ｈ）含水量（％）萌发率（％）０４１． １２９４．３０２４２８．５０９３．１２４８１８．７９９５．５１７２１２．０５９４．４７ ９６８．２１９４．３４表２种子含水量对冷冻保存的影响含水量（％）萌发率（％）４１．１２ ０２８．５０１８．６９１８．７９９２．３４１２．０５９２．９３８．２１９４．０６２．３ 解冻方法对种子萌发率的影响采用两种方法解冻，试验结果表明，在室温（２０℃）下慢速化冻和 ４０℃水浴上快速化冻，种子的萌发率是一致的（表３）。大量实验证实，植物冻害发生在冰冻和 化冻两个过程中，为了在化冻时防止细胞内次生结冰，需要采用快速化冻方法，即在３５～４０℃ 温度下化冻。于是铁皮石斛种子经超低温冷冻后，采用４０℃下快速解冻。表３解冻方法对种子萌 发率的影响含水量（％）萌发率（％）４０℃（１ｍｉｎ）２０℃（３０ｍｉｎ）２８．５０１８ ．６９１９．４８１８．７９９２．３４９５．２８１２．０５９２．９３９５．５０８．２１９ ４．０６９３．５０２．４再培养方法对种子萌发率的影响将冷冻后的铁皮石斛种子转移到１／２ ＭＳ培养基上，分为２组，一组直接放在光下培养；另一组，先在黑暗中培养１周，再转入光下培 养。这２组种子的萌发率差异不明显。用干燥脱水２４ｈ种子试验，直接在光下培养萌发率为１６ ．６１％，先黑暗培养，再转入光下者为１８．２６％。这与甘蔗等培养物超低温保存后再培养的 试验结果不同，甘蔗等培养物培养于黑暗条件下能较快地恢复生长，尔后生长速度也较快，存活率 也较高〔５〕。２．５超低温保存时间对种子萌发率的影响经２４ｈ干燥脱水的种子，在液氮中保 存２４ｈ或１个月的试验表明，前者的萌发率为１８．２６％，后者为１８．１０％。二者基本一 致。这说明种子在液氮中可长期保存。２．６超低温保存后种子的萌发与成苗超低温保存的种子萌 发有一个滞后期，比正常种子萌发延迟７～１０天。但萌发后的种子的发育过程与未经超低温保存 的种子一样，在１／２ＭＳ培养基上，先萌发成原球茎，原球茎长出２～３片真叶后，转入附加香 蕉提取液的培养基上，可形成完整的植球。３结语干冻法是一种简便高效的超低温保存方法。只要 选择的材料合适，脱水的程度是一个关键。使材料脱水到一个适宜的含水量范围。一些花粉采用此 法都获得成功〔６～９〕。铁皮石斛种子抗脱水性强，当种子含水量控制在８％～１８％，其萌发 率与未经冷冻的种子相似，并形成正常植株。这一实验结果，为铁皮石斛种质的长期保存提供了新 的途径。为珍稀濒危药用植物种质库的建立提供科学依据。参考文献１刘瑞驹，蒙爱东，邓锡青， 等．铁皮石斛试管苗快速繁殖的研究．药学学报，１９８８；２３：６３６２张治国，刘骅，王黎 ，等．铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究．中草药，１９９２；２３：４３１３张治国，王黎， 刘骅，等．铁皮石斛原球茎分化适宜培养基研究．中国中药杂志，１９９３；１８：１６４叶秀米 舛，程式君，王伏雄，等．黑节草未成熟种子的形态发育及其在离体培养时的表现．云南植物研究 ，１９８８；１０：１８５５孙敬三，桂耀林主编．植物细胞工程实验技术．北京：科学出版社， １９９５：３１８６江雨生，高铸九．桃、梨花粉的超低温（－１９６℃）贮藏．上海农业学报， １９８９；５：１７石思信，田王月．超低温（－１９６℃）中保存一年的黑麦花粉生活力．植物 生理学报，１９８９；１５：３９３８陈品良，贺善安，金炜．杜仲、秤锤树花粉的超低温贮藏研 究．植物学报，１９９０；３２：２８８９陈霜莹，常永健，赵艳华，等．果树花粉的超低温保存 ．华北农学报，１９９３；８（增刊）：６０ＣＲＹＯＰＲＥＳＥＲＶＡＴＩＯＮＯＦＳＥＥＤＳ ＯＦＤＥＮＤＲＯＢＩＵＭＣＡＮＤＩＤＵＭＺｈａｎｇＺｈｉｇｕｏＬｉｕＨｕａＸｉａＺｈｉ ｊｕｎＷａｎｇＪｕｎｈｕｉ（ＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎ ｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，３１００１３）ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍｃａｎｄ ｉｄｕｍｉｓｏｎｅｏｆｐｒｅｃｉｏｕｓｅｒａｒｅａｎｄｔｈｒｅａｔｅｎｅｄｍｅｄｉｃｉ ｎａｌｐｌａｎｔｓ．Ｉｔｓｇｅｒｍｐｌａｓｔｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｉｓｖｅｒｙｉｍｐ ｏｒｔａｎｔｆｏｒｒｅｓｏｕｒｃｅｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｍａｓｃｕｌｔｉｖａｔ ｉｏｎ．Ｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｓｅｅｄｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ，ｔｈａｗｉｎｇｍｅｔｈ ｏｄｓ，ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｓ，ｓｔｏｒａｇｅｔｉｍｅｏｎｇｅｒｍｉｎａｔ ｉｏｎｒａｔｅｏｆｓｅｅｄｓｓｔｏｒｅｄｉｎｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＬＮ）ｗｅｒ ｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｅｅｄｗａｔｅｒｃｏｎｔｅ ｎｔｉｓｋｅｙｆａｃｔｏｒｆｏｒｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｉｎＬＮ．Ｔｈｅｓｅｅ ｄｓｗｅｒｅｄｒｉｅｄｔｏｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ８％～１８％ｂｅｆｏｒｅｂｅｉｎｇｐ ｕｔｉｎｔｏＬＮｆｏｒａｐｅｒｉｏｄｏｆｔｉｍｅ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈａｗｅｄｉｎ４０℃ ｗａｔｅｒｂａｔｈｆｏｒ１ｍｉｎｕｔｅ．Ｔｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｓｅｅ ｄｓｒｅａｃｈｅｄ９２％～９５％．ＳｅｄｓｓｔｏｒｅｄｉｎＬＮｃｏｕｌｄｎｏｒｍａｌｙ ｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓｉｎｓｕｉｔａｂｌｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ．ＫＥＹＷ ＯＲＤＳ：Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ；Ｓｅｅｄｓ；Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔ ｉｏｎ；Ｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎ铁皮石斛种子的超低温保存研究@张治国@刘骅@夏志俊 @王君晖$浙江省医学科学院药物研究所$杭州大学生命科学院铁皮石斛；种子；超低温保存；液 氮研究影响铁皮石斛种子超低温保存的一些主要因素：种子含水量、解冻方法、恢复生长方法、保 存时间等。结果表明，含水量是超低温保存的主要因素，种子含水量降到８％～１８％，直接投入 液氮中，经保存后，４０℃水浴上快速解冻，种子萌发率为９２％～９５％，与未经冷冻的种子的 萌发率一致，并生长成正常植株。１刘瑞驹，蒙爱东，邓锡青，等．铁皮石斛试管苗快速繁殖的研 究．药学学报，１９８８；２３：６３６２张治国，刘骅，王黎，等．铁皮石斛原球茎增殖的培养 条件研究．中草药，１９９２；２３：４３１３张治国，王黎，刘骅，等．铁皮石斛原球茎分化适 宜培养基研究．中国中药杂志，１９９３；１８：１６４叶秀米舛，程式君，王伏雄，等．黑节草 未成熟种子的形态发育及其在离体培养时的表现．云南植物研究，１９８８；１０：１８５５孙敬三，桂耀林主编．植物细胞工程实验技术．北京：科学出版社，１９９５：３１８６江雨生，高铸九．桃、梨花粉的超低温（－１９６℃）贮藏．上海农业学报，１９８９；５：１７石思信，田王月．超低温（－１９６℃）中保存一年的黑麦花粉生活力．植物生理学报，１９８９；１５：３９
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