环孢素A(CyclosporinA,CsA)是从真菌代谢产物中分离得到的含11个氨基酸的 环状多肽,临床上常用于器官移植后抗排异反应,近年来也用于治疗某些自身免疫性疾病〔1〕。
Cyclophilin(CyP)即环孢素A结合蛋白,是CsA的细胞内蛋白受体。业已发现 ,有多种异构体存在,构成Cyclophilin家族〔2,3〕。尽管各成员间分子量不等, 对CsA亲和力不同,在细胞内分布不一,但鉴于其广泛的种属和组织分布,结构高度保守以及共 同的肽酰脯氨酰顺反异构酶(peptidylprolylcistransisomeras e,PPIase)活性,提示CyP在细胞内具有重要的生理功能。1 CyP家族的分类、分 布及特征 1984年从小牛胸腺中分离、纯化出第1个CsA受体,被命名为Cycloph ilin,后称CyclophilinA(CyPA)〔4〕。之后,特别是近几年,已从动物 、植物、细菌、酵母菌等生物体中获得了大量结构高度同源的CyP〔2,3〕。目前,按CyP 在细胞中的分布及氨基酸序列等特征,CyP家族可分为CyclophilinA(CyPA) 、CyclophilinB(CyPB)、CyclophilinC(CyPC)、Cycl ophilinD(CyPD)、Cy-clophilin40(CyP40)、Cyclop hilin160(CyP160)等六个亚族。CyPA位于细胞质,是CsA主要受体,各种 属间的CyPA同源性高〔8〕。CyPB、CyPC、CyPD的氨基酸序列与CyPA同源性 也高,尤其是核心序列几乎完全相同。与CyPA不同的是其N端有信号肽,将其导入内质网(C yPB、CyPC)或线粒体(CyPD)〔3〕。CyP40和CyP160是最近发现的分子 量较大的CyP成员。CyP40又称雌激素受体结合CyP(estrogenrecepto rbindingcyclophilin,ERBC),为钙调素结合蛋白,最初是从小牛大脑 中分离出来的,位于细胞质内。在结构上N端有CyPA同源区,C端有钙调素结合区〔5〕。C yP160又称为NK细胞肿瘤识别分子(naturalkillercelltu-mour -recognitionmolecule,NK-TR),位于细胞膜上,其结构与CyP4 0类似,N端也有CyPA同源区。此外,还有疏水区、3个与组蛋白同源的带电区,以及3个富 含丝氨酸、苏氨酸区〔6〕。CyP家族各成员特征见附表。附表 人类CyP的主要特征名 称氨基酸数细胞内分布分子量等电点与CyPA同源性(%)PPIase活性CsA亲合性(I C50nmol/L)CyPA 165细胞质18000碱性-+ 6CyPB 20 8内质网21000碱性 64+9CyPC 212内质网23000碱性55.8+6C yPD 164线粒体18000碱性76+10CyP40370细胞质40000酸性60* +300CyP160403细胞膜160000碱性80*+770 注:+有PPIas e活性 *N端CyP相关区与CyPA同源性 IC5050%抑制浓度2 CyP的空间构象 X晶体衍射分析显示,CyPA主要二级结构单元为β-片层折叠。此外,还有α螺旋、β- 转角以及无规线团。8条反平行的β-折叠片分别与环(loop)和包埋于β-折叠片两端的3 条α螺旋相连接,形成一个右手β-桶型结构(aright-handedβ-barrel- typestructure),核心充满疏水性侧链〔7〕。核磁共振(NMR)显示,CyP A中Arg55、Phe60、Met61、Gln63、Gly72、Ala101、Asn1 02、Ala103、Gln111、Phe113、Trp121、Leu122、His12 6这13个氨基酸与CsA接触,在各亚类CyP中都相当保守。如这些氨基酸突变,则影响与C sA的亲和性。CyP分子的PPIase活性中心就是CsA的结合部位。CyPA与CsA结 合后的构象与一枚硬币部分插入自动售物机投币孔相似,CsA43%的表面积被CyPA包埋, 而CyPA的构象几乎不变〔8〕。3 CyP与FKBP的关系 FKBP(FK506bi ndingprotein,FKBP)即FK506结合蛋白,是另一类能与免疫抑制剂FK5 06、雷帕霉素(Rapamycin)结合的蛋白质〔3〕。FKBP的结构与CyP完全不同 ,但令人惊奇的是二者却都有相似的性质:1FKBP也有PPIase活性,与配体结合后酶活 性被抑制;2FKBP也是一个由FKBP-12、FKBP-13、FKBP-25、FKBP -52等成员组成的蛋白质家族;3FKBP分布广泛,在进化中也非常保守;4FKBP也能介 导免疫抑制作用。但令人不解的是,结构与结合蛋白都不同的CsA和FK506免疫抑制作用方 式相同,而结构及结合蛋白都相似的FK506和雷帕霉素免疫抑制作用方式却不同。4 CyP 活性测定 测定CyP活性的方法很多,但以α糜蛋白酶活性测定法(α-chymotryp sin-coupledenzymicassay)最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物,如 N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe对硝基苯胺在溶液中其顺式、反式结构处于平衡, CyP能催化该底物顺反异构作用;当其处于反式结构时,C端被α-糜蛋白酶裂解,释放出色素 基团对硝基苯胺,连续测定吸光值的变化即可得知CyP的PPIase活性〔9〕。5 CyP 的生物学功能5.1 PPIase活性 脯氨酰基顺反异构是蛋白质折叠反应的限速步骤之一, 体内被PPIase所催化。这在蛋白质折叠的起始过程中,对形成有活性的空间结构非常必要。 各类CyP均有PPIase酶活性,因而CyP在各生物体细胞中的基本作用可能是催化蛋白质 折叠的起始过程及其寡聚体重排过程中的限速步骤,并起分子伴侣(molecularchap erone)作用〔3,6〕。例如,果蝇nina基因能表达一种分子量26000的CyP, 与CyPA同源达40%,只存在于果蝇的视杆细胞中。它能催化视紫红质Rh1、Rh2的折叠 ,也是Rh1、Rh2从内质网通过细胞质进入细胞膜表面的必需因子。若该基因突变,则可导致 感光细胞功能障碍〔10〕。5.2 介导CsA的免疫抑制作用 由于CsA与CyP结合后能 抑制后者的酶活性,起初认为CsA免疫抑制作用与CyP的PPIase活性有关。然而,后来 通过CsA衍生物与CyP相互作用,以及CyP的PPIase活性部位氨基酸突变证实,抑制 PPIase活性并不能解释CsA的免疫抑制作用〔11〕。目前认为,CsA的免疫抑制作用 与依赖Ca2+/钙调素的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(
Calcineurin,CaN,又称 神经钙蛋白)有关。CaN是淋巴细胞中一种关键的信号酶,也是目前唯一已知其活性受第二信使 Ca2+调控的蛋白磷酸酶。它由分子量61000的催化亚基(CalcineurinA)和 分子量19000的调节亚基(CalcineurinB)组成。CsA进入体内,先与CyP (可能是CyPA,也可能是CyPB)结合,形成CyP-CsA复合物,再与Calcine urinB结合,抑制Calcineurin活性,使该底物即激活的T细胞核因子(nucl earfactorofactivatedTcells,NF-ATc)等不能被去磷酸化, 使其不能从细胞质向细胞核转位,从而在转录水平阻断淋巴细胞活化〔3,12,15〕。当然, 这一理论还不甚完善,尚有许多问题有待于解决。比如Cal-cineurin底物问题以及考 虑到CyP家族各成员存在于同一个体内,到底是哪一类CyP介导免疫抑制作用目前尚不清楚。 5.3 免疫调节作用 从CyP介导CsA的免疫抑制作用的机理推测,CyP可能与某些基因 的转录与翻译有关。体内也可能存在CyP的天然配体,它们与各类CyP结合,形成一种新的免 疫调节网络,调节机体的免疫功能。Bram等人发现,在T淋巴细胞中存在着一种称之为Ca2 +信号调节CyP配体(cal-ciumsignalmodulatingcyclophi linligand,CAML),可能是CyPB的天然配体。当其在T细胞中高度表达时,能 引起Ca2+的内流,从而激活淋巴细胞内依赖Ca2+的信号传导途径,对T淋巴细胞起正免疫 调节(上调)作用〔45〕。体内也许存在着结构类似于CsA、FK506等的天然配体,它们 与各类CyP结合后起负免疫调节(下调)作用。5.4 诱导某种细胞凋亡
细胞凋亡(apo p-tosis)是机体生长发育、细胞分化和病理状态下细胞自主性死亡的过程,又称为程序性 细胞死亡(pragrammedcelldeath)。在体内外影响细胞凋亡的因素很多。M ontague等人发现重组CyPA、CyPB、CyPC有依赖Ca2+/Mg2+的核酸酶 活性,可能在某些淋巴细胞凋亡中起作用〔14〕。这恰可解释Fruman等人有关CsA可以 预防某些类型的淋巴细胞凋亡的发现〔15〕。CyP引起细胞凋亡的机理不详,也许是与CyP 的核酸酶活性有关,也许是CyP可以通过Ca2+信号传递途径影响调控细胞凋亡的基因表达而 间接地调控细胞凋亡。5.5 CyP与IL-8 体外实验证实,CyPA对中性粒细胞、嗜酸 粒细胞有趋化作用。该作用能被CsA以及CsA衍生物所抑制。用Westernblot检查 ,发现IL-8抗血清能与CyPA交叉反应。IL-8的空间构象与CyPA相似,也能与CsA特异结合。这可以解释CsA的抗炎作用。不同的是IL-8没有PPI-ase活性,也许IL-8是CyP家族中无PPIase活性的成员〔16〕。5.6 CyP与某些免疫病相关 1992年,Harigai等人首先在系统性红斑狼疮(SLE)患者血清发现IgG类和Ig
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