反相高效液相色谱法同时测定血清维生素Ａ和维生素Ｅ李润亭任鲁泰周爱芬王平高静摘要采用反相Ｈ ＰＬＣ紫外检测法，利用同一内标物（视黄醇醋酸酯），同时测定血清视黄醇和α生育酚。本法 在视黄醇为１０００μｇ／Ｌ、α生育酚为１０ｍｇ／Ｌ内线性良好。视黄醇最低检限为１０μ ｇ／Ｌ，回收率为９６２４％，批内和批间ＣＶ值分别为３１％和３３％；α生育酚最低 检限为０５ｍｇ／Ｌ，回收率为９７２２％，批内和批间ＣＶ值分别为３８％和３９％。 结果表明，本法可对血清视黄醇和α生育酚作出较灵敏和准确的测定。用本法分析了健康人和部 分心、脑血管病患者血清视黄醇和α生育酚含量，并对其临床意义进行了初步探讨。关键词视黄 醇α生育酚高效液相色谱法中图法分类号Ｒ９２７２近年来研究发现，维生素Ａ（ＶＡ）和维 生素Ｅ（ＶＥ）在人体内具有重要生理作用，并与心脑血管疾病、肝病和癌症等的发生和发展关系 密切。新近有人提出“维生素缺乏比胆固醇高更有害于心脏”的见解，认为维生素具有改善血液循 环，保持血管正常弹性、抗氧化和消除自由基等多种生理功能。因此，测定血清ＶＡ和ＶＥ的含量 具有重要意义。以往测定ＶＡ和ＶＥ多用比色法、分光光度法和荧光法等，但最理想的方法是ＨＰ ＬＣ法，不仅快速准确，且能同时测定ＶＡ和ＶＥ。我们在参考国内外有关文献的基础上［１２， ５］，采用６０℃水浴蒸干代替氮气吹干，用反相ＨＰＬＣ法同时测定视黄醇（ＶＡ１）和α生 育酚取得满意结果。现报道如下。１材料和方法１１仪器与试剂日本岛津ＬＣ－１０Ａ型ＨＰＬ Ｃ仪，包括ＬＣ－１０ＡＤ恒流泵，ＳＰＤ－１０Ａ可见紫外检测器，Ｃ－Ｒ７Ａ数据处理系统， ＳＣＬ－１０Ａ系统控制器，ＣＴＯ－１０Ａ柱温箱；岛津ＵＶ－２１０１ＰＣ型紫外分光光度计 。无水乙醇（ＡＲ），甲醇（ＡＲ），正己烷（ＧＲ），视黄醇（Ｓｉｇｍａ），视黄醇醋酸酯（ Ｓｉｇｍａ），α生育酚（Ｓｉｇｍａ）。１２色谱条件ＳｈｉｍＰａｃｋＣＬＣ－ＯＤ ＳＣ１８反相色谱柱６０ｍｍ×１５０ｍｍ；流动相：甲醇；流速：开始１５ｍｌ／ｍｉｎ， ６ｍｉｎ后２ｍｌ／ｍｉｎ；检测波长：开始３２５ｎｍ，６ｍｉｎ后２９２ｎｍ；记录时间９ｍ ｉｎ，灵敏度：０００５ＡｕＦｓ；积分仪的衰退为００５；纸速：２ｍｍ／ｍｉｎ；进样量 ２０μｌ。１３标准液配制以无水乙醇分别配制视黄醇、α生育酚及视黄醇醋酸酯（内标）贮 存液，其浓度分别为１００ｍｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ，－２０℃避光保存。临用前将 上述贮存液用无水乙醇配成２０ｍｇ／Ｌ应用标准液（用ＵＶ－２１０１ＰＣ校正，视黄醇３２５ ｎｍＥ１％１ｃｍ１７８０，α生育酚２９２ｎｍＥ１％１ｃｍ７５８，视黄醇醋酸酯３２５ ｎｍＥ１％１ｃｍ１６００［３］）。标准曲线绘制：用上述应用标准液配制混合标准系列，视黄 醇浓度分别为１００、２００、３００、４００、５００μｇ／Ｌ；α生育酚为２ｍｇ／Ｌ、４ ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ，视黄醇醋酸酯均为５００μｇ／Ｌ。混合均 匀，进样２０μＬ，照上述色谱条件测定，以峰高比为纵座标，浓度比为横座标作图，并求视黄醇 和α生育酚的斜率［３４］。１４样品测定标本的预处理：血清１００μｌ，蒸馏水１００μ ｌ，视黄醇醋酸酯内标液（５００μｇ／Ｌ）２００μｌ，顺序加入５ｍｌ尖底磨口离心管中，旋 涡混匀５ｓ；加入正己烷６００μｌ，旋涡混匀２ｍｉｎ，１０００ｇ离心１０ｍｉｎ；吸取上层 正己烷提取液３００μｌ加入另一磨塞小试管中，置６０℃水浴蒸干，管中提取物用１００μｌ无 水乙醇溶解，旋涡混匀３０ｓ后进样２０μｌ，照上述色谱条件测定。定量计算：总洗脱时间为９ ｍｉｎ，视黄醇、视黄醇醋酸酯、α生育酚的保留时间分别为３４ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、７ ５ｍｉｎ（见图）。根据标准系列中各成分浓度及其内标之间求得的标准曲线斜率，按内标计算 方法计算出血清样品中视黄醇和α生育酚的含量。出峰顺序依次为溶剂、视黄醇、内标、α生 育酚。２结果与讨论２１回收试验和重复试验回收试验是通过在已知含量的血清中分别加入不同 浓度的视黄醇标准液和α生育酚标准液，经预处理，进样后所计算的结果与原值相比较。重复性 试验为同一份血清等份分装，分三天测定，每天１０份作批内、批间试验。视黄醇的回收率为９６ ２４％，α生育酚的回收率为９７２２％；视黄醇的批内和批间ＣＶ值分别为３１％和３ ３％，α生育酚的批内、批间ＣＶ值分别为３８％和３９％。２２灵敏度和线性范围按 标准系列中视黄醇和α生育酚的递增浓度及其与内标峰高比值绘制的标准曲线，其含量分别为视 黄醇１０００μｇ／Ｌ、α生育酚１０ｍｇ／Ｌ范围内线性良好。最低检测量分别为视黄醇１０ μｇ／Ｌ、α生育酚０５ｍｇ／Ｌ。２３应用ＨＰＬＣ法同时测定ＶＡ和ＶＥ可共用同一视 黄醇醋酸酯内标液，且α生育酚的结果准确可靠，层析所需时间比用α生育酚醋酸酯作内标的 时间短。另外，α生育酚醋酸酯还可存在于服用酯化形式ＶＥ的人血清中，影响测定结果。２ ４正常参考值范围应用本法测定了４４例健康人血清ＶＡ和ＶＥ的含量，年龄１８岁５５岁，其中 男性２４例，女性２０例，ＶＡ（视黄醇）ｘ±ｓ＝７２１８±１４９２μｇ／Ｌ，ＶＥ（α 生育酚）ｘ±ｓ＝８６７ｍｇ／Ｌ±１７８ｍｇ／Ｌ。本文报道的ＶＡ和ＶＥ正常参考范围 与文献报道基本一致，如文献报道成人血清ＶＡ３２０μｇ／Ｌ９００μｇ／Ｌ［３］。血清中Ｖ Ｅ有α、β和γ三种异构体，其中α生育酚占总生育酚的８２６％９３３％，生物学 活性最大。本法测定的是α生育酚，有文献报道ＶＥ正常参考范围较高，往往是总生育酚的水平 。２５用本法测定了２０例心、脑血管疾病患者血清ＶＡ和ＶＥ含量其中脑梗塞１３例，冠心病 ７例。ＶＡｘ±ｓ＝５６１５μｇ／Ｌ±２２８４μｇ／Ｌ，ＶＥｘ±ｓ＝１０６５ｍｇ／ Ｌ±２１９ｍｇ／Ｌ。与健康人比较，心、脑血管病患者血清ＶＡ含量明显降低（Ｐ＜００５ ）。实验证明ＶＡ与心、脑血管病的发生与发展有密切关系，据报道美国有３００名罹患冠心病的 医生坚持服用ＶＡ，结果男子患心肌梗塞的机率减少了一半，女子减少了２０％，故血清ＶＡ测定 可作为心、脑血管病的辅助诊断指标。而心、脑血管病患者血清ＶＥ不仅未降低，反而高于健康人 ，可能与临床治疗过程中服用ＶＥ有关。附图混合标准系列中各标准的层析图参考文献１Ｚａｈｕ ｒｚａｍａｎ，ＰｅｔｅｒＥｉｅｌｄｅｎ．ａｎｄＰｅｔｅｒＧ．Ｆｒｏｓｔ．Ｓｉｍｕｌｔａ ｎｅｏｕｓＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＶｉｔａｍｉｎｓＡａｎｄＥａｎｄＣａｒｏｔｅ ｎｏｉｄｓｉｎＰｌａｓｍａｂｙＲｅｖｅｒｓｅｄＰｈａｓｅＨＰＬＣｉｎＥｉｄｅｒｌｙａ ｎｄＹｏｕｎｇｅｒＳｕｂｊｅｃｔｓ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ，１９９３，３９：２２２９．２胡雷 光，戴湘茹，李俊．血清视黄醇和α生育酚ＨＰＬＣ检测法的改良．上海医学检验杂志，１９９ ５，１０：２２．３林其燧，文庆成等译．临床化学诊断方法大全．北京：北京大学出版社，１９ ９０：１５０２．４ＣｕｅｓｔａＳＤ，ｅｔａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｍｅａｓｕｒｅｍ ｅｎｔｏｆｒｅｔｉｎｏｌａｎｄａｌｐｈａｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｉｎｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ ｂｙＨＰＬＣｗｉｔｈｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ， １９８６，３８０：１４０．５周捷，李培成．血清维生素Ａ和Ｅ的微量荧光测定法．中华医学检 验杂志，１９８９，１２：３４６．反相高效液相色谱法同时测定血清维生素A和维生素E@李润 亭@任鲁泰@周爱芬@王平@高静$济南市解放军济南医高专视黄醇,α-生育酚,高效液相色谱 法采用反相ＨＰＬＣ紫外检测法，利用同一内标物（视黄醇醋酸酯），同时测定血清视黄醇和α 生育酚。本法在视黄醇为１０００μｇ／Ｌ、α生育酚为１０ｍｇ／Ｌ内线性良好。视黄醇最低 检限为１０μｇ／Ｌ，回收率为９６２４％，批内和批间ＣＶ值分别为３１％和３３％；α 生育酚最低检限为０５ｍｇ／Ｌ，回收率为９７２２％，批内和批间ＣＶ值分别为３８％ 和３９％。结果表明，本法可对血清视黄醇和α生育酚作出较灵敏和准确的测定。用本法分析 了健康人和部分心、脑血管病患者血清视黄醇和α生育酚含量，并对其临床意义进行了初步探讨 。１Ｚａｈｕｒｚａｍａｎ，ＰｅｔｅｒＥｉｅｌｄｅｎ．ａｎｄＰｅｔｅｒＧ．Ｆｒｏｓｔ．Ｓ ｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＶｉｔａｍｉｎｓＡａｎｄＥａｎｄ ＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｉｎＰｌａｓｍａｂｙＲｅｖｅｒｓｅｄＰｈａｓｅＨＰＬＣｉｎＥｉ ｄｅｒｌｙａｎｄＹｏｕｎｇｅｒＳｕｂｊｅｃｔｓ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ，１９９３，３９：２２ ２９．２胡雷光，戴湘茹，李俊．血清视黄醇和α生育酚ＨＰＬＣ检测法的改良．上海医学检验 杂志，１９９５，１０：２２．３林其燧，文庆成等译．临床化学诊断方法大全．北京：北京大学 出版社，１９９０：１５０２．４ＣｕｅｓｔａＳＤ，ｅｔａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｍｅ ａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｒｅｔｉｎｏｌａｎｄａｌｐｈａｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｉｎｈｕｍａ ｎｓｅｒｕｍｂｙＨＰＬＣｗｉｔｈｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＪＣｈｒｏｍ ａｔｏｇｒ，１９８６，３８０：１４０．５周捷，李培成．血清维生素Ａ和Ｅ的微量荧光测定法 ．中华医学检验杂志，１９８９，１２：３４６．靠，层析所需时间比用α生育酚醋酸酯作内标的时间短。另外，α生育酚醋酸酯还可存在于服用酯化形式ＶＥ的人血清中，影响测定结果。２４正常参考值范围应用本法测定了４４例健康人血清ＶＡ和ＶＥ的含量，年龄１８岁５５岁，其中男性２４例，女性２０例，ＶＡ（视黄醇）ｘ±ｓ＝７２１８±１４９２μｇ／Ｌ，ＶＥ（
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