茵陈蒿汤对急性胰腺炎胰腺泡溶酶体膜稳定性的影响刘博高静涛杨雅珍裴德恺（病理生理教研室）摘 要用ＤＣＡ—Ｎａ，诱发大鼠急性胰腺炎（ＡｃｕｔｅＰａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ），探讨ＡＰ的 发病机制；对比茵陈蒿汤及其组分对胰腺腺泡溶酶体膜稳定性的影响。按析因法设计实验。用差速 离心技术，以２５０００ｇ３０分钟分离溶酶体。测上清及沉淀中溶酶体标记酶—酸性磷酸酶（Ａ ＣＰ）的活性，以总酶活比作为溶酶体膜稳定性的主要指标。结果显示：各中药治疗组沉淀溶酶体 ＡＣＰ活性较盐水组高，而总酶活比显著降低，接近正常组。提示：ＡＰ时胰腺腺泡溶酶体膜稳定 性降低，而茵陈蒿汤及其组分对溶酶体膜有保护作用。关键词茵陈蒿汤；急性胰腺炎；溶酶体膜稳 定性；酸性磷酸酶胰腺“自身消化”是急性胰腺炎（ＡＰ）发病学的传统学说。然而有关期确切机 制迄今仍不十分清楚〔１〕〔７〕。近年来Ｓｔａｎｄｆｉｅｌｄ等提出溶酶体膜的稳定性在胰腺 “自身消化”中起重要作用。而国内此方面研究尚少。茵陈蒿汤由茵陈、栀子和大黄三味药组成， 这是治疗湿热黄疸的经典名方。根据胆胰同病以及异病同治的中医理论，发现其重要成份栀子对Ａ Ｐ胰腺泡膜系统的性状和功能有明显的影响〔１〕〔２〕〔３〕；而大黄对临床和实验性ＡＰ有治 疗作用〔４〕〔５〕。鉴于上述原因，本实验目的（１）探讨ＡＰ时溶酶体膜稳定性的变化。（２ ）运用析因设计就中医消黄名方—茵陈蒿汤及其组分对ＡＰ溶酶体膜稳定性的影响进行分析比较， 以期为开发治疗ＡＰ的药物辟出一条新路。１材料和方法１．１动物分组取健康ＳＤ大鼠５４只， 雌雄各半，体重３００ｇ左右，随机区组设计分成九组：正常组、胰炎盐水组（对照组）、胰炎茵 陈组、胰炎栀子组、胰炎大黄组、胰炎茵陈蒿汤组、胰炎茵陈栀子组、胰炎茵陈大黄组、胰炎栀子 大黄组。每组９只，常规分笼饲养、进行配伍实验。１．２ＡＰ动物模型的制备大鼠隔夜禁食１８ ｈ，在乙醚麻醉下行无菌手术，向胰胆管内逆行注入１．５％去氧胆酸钠（ＤＣＡ—Ｎａ）０．０ ５ｍｌ／１００ｇ体重，诱发ＡＰ。１．３药物制备与给药方法（１）茵陈（辽宁产）１００％（ Ｗ／Ｖ）、栀子（贵州产）５０％、大黄（辽宁产）５０％组成茵陈蒿汤，分别用适量的蒸馏水浸 泡ｌｈ，前二味药用文火煎开０．５ｈ入大黄再沸为度。单味药及两味药的组方剂量及制备方法同 上。（２）给药方法：除正常组外、其余各组分别于手术前ｌｈ、术后４ｈ及实验前ｌｈ经口灌服 相应中药煎剂及生理盐水供３次，剂量为１ｍｌ／１００ｇ体重。１．４溶酶体的制备（１）胰匀 浆制备：断头处死大鼠，立即剖腹按固定部位迅速取出胰腺、用４℃生理盐水冲洗去残血。在冰浴 中加１５０ｎｍｏｌｋｃｌ－１０ｎｍｏｌＴｒｉｓ－Ｈｃｌ缓冲液（ｐＨ７．４）２ｍｌ，剪碎 胰腺，将碎块移入研磨器中再加入上述缓冲液５ｍｌ。研磨１分半钟将胰浆放入１０ｍｌ离心管中 ４℃保存准备差速离心。（２）差速离心溶酶体：高速低温冷冻离心机在４℃条件下先以６００ｇ 离心１０分钟去沉淀、上清１２０００ｇ离心２０分钟，弃沉淀。取上清２５０００ｇ离心３０分 钟，所得沉淀即为溶酶体。放入－２０℃冰箱保存。１．５溶酶体标记酶—酸性磷酸酶ＡＣＰ测定 采用磷酸苯二钠法。蛋白测定用Ｌｏｗｒｙ氏法。１．６操作程序（１）上清中ＡＣＰ的测定：取 沉淀溶酶体上清５０μｌ，测ＡＣＰ，反映ＡＣＰ从溶酶体中释出量。（２）沉淀中ＡＣＰ的测定 ：取沉淀量加０．２Ｍ拘橼酸缓冲液（ｐＨ４．９）０．９ｍｌ，加１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ （破膜剂）０．１ｍｌ，吹打混匀成悬液，取５０μｌ测ＡＣＰ，反映溶酶体内ＡＣＰ含量。１． ７数据处理采用（Ｄｕｎｎｅｔ＇ｓｔ）检验、两样本均数比较ｔ检验、２３析因分析法分析两味 药组方的一级和茵陈蒿汤的二级交互作用。２实验结果２．１上清中ＡＣＰ活性变化正常组为８． ８μ／ｍｇ±１．７μ／ｍｇＰｒｏ－ｔｅｉｎ，对照组最高为９．１μ／ｍｇ±２．３μ／ｍｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ、栀子和茵陈蒿汤组最低分别为６．５μ／ｍｇ±０．８μ／ｍｇＰｒｏｔｅｉｎ 和６．５μ／ｍｇ±１．１μ／ｍｇＰｒｏｔｅｉｎ。统计学处理表明：栀子、大黄、茵陈蒿汤及 茵陈栀子组与对照组比较差异显著（Ｐ＜０．０５）、表明对照组上清中ＡＣＰ活性显著高于上述 治疗组。除茵陈和茵陈大黄组外，其它各治疗组与正常组比较ＡＣＰ活性显著降低（Ｐ＜０．０５ ）。而正常组与对照组治疗组间比较无明显差异。见表１。２．２沉淀中ＡＣＰ活性变化各组中， 正常组胰腺溶酶体中ＡＣＰ活性最高为９．０μ／ｍｇ±２．３μ／ｍｇＰｒｏｔｅｉｎ，对照组 最低为６．２μ／ｍｇ±１．３μ／ｍｇＰｒｏｔｅｉｎ，中药治疗组介于两者之间，统计处理显 示：对照组与正常组及茵陈组比较差异显著（Ｐ＜０．０５）。而各用药组间及与正常组比较无统 计学意义。见表１。２．３上清及沉淀中总酶活性变化正常组ＡＣＰ活性为９．７μ／ｍｇ±２． ０μ／ｍｇＰｒｏｔｅｉｎ对照组为９．０μ／ｍｇ±２．４μ／ｍｇＰｒｏｔｅｉｎ，栀子及大 黄组与对照组相比ＡＣＰ活性显著降低（Ｐ＜０．０５）。茵陈蒿汤组因其标准差较大未显统计学 差异。除茵陈及茵陈大黄组外，其余各治疗组ＡＣＰ总活性较正常组显著降低（Ｐ＜０．０５）。 而正常组与对照组及治疗组间比较均无统计学意义。见表１。表１上清、沉淀溶酶体中酸性磷酸酶 活性值及总酶活性值正常对照中药处理茵陈栀子大黄茵陈蒿汤茵陈栀子茵陈大黄栀子大黄上清中８ ．８±１．７９．１±２．３６．９±１．５６．５±０．８＊６．７±０．６＊６．５±１．１ ＊６．７±０．４＊７．５±０．９７．０±０．９沉淀溶酶体中９．０±２．３＊６．２±１． ３８．０±１．２＊７．２±０．６７．２±１．０７．７±１．８８．０±１．６７．４±１． １８．０±１．７总酶活性９．７±２．０９．０±２．４７．２±２．１６．６±１．１＊６． ８±１．０＊６．８±２．０６．９±１．０７．６±０．８７．２±１．３＊Ｐ＜０．０５Ｐ与 对照组比较２．４总酶活性比值的变化总酶活性比值以对照组最高为１７．０９±４．０７，栀子 大黄组最低为９．７７±２．９７。其中对照组与正常组之间差异显著（Ｐ＜０．０１），其它各 用药组与对照组比较差别亦十分显著（Ｐ＜０．０１）。而正常组与各用药组及用药组间无明显差 异。析因分析提示：各用药组方无一级和二级交互作用。经效应估计得出总酶活性比降低的顺序依 次为：栀子、大黄、茵陈蒿汤及茵陈组。见表２及附图。表２上清与沉淀溶酶体中酸性磷酸酶总活 性比值正常对照中药处理茵陈栀子大黄茵陈蒿汤茵陈栀子茵陈大黄栀子大黄Ｔｏｔａｌｘ９．９８ １２．２１８．３５１０．４６８．３３８．４１８．７３１０．９２７．３５１２．９９１７． ５９１９．２８１２．６８１３．７９１２．５３１５．９０１１．７０１４．１９９．３３１４ ．８１７．７２８．８１９．１４７．８３１１．０７９．６７８．９２７．７７１７．０８６． ８０８．５７７．４７５．６９６．９８８．５９６．２５８．２４１６．４７９．３５１０．９ ６１２．２３１０．９８９．４８１０．０６９．７９１２．６７２４．３８１３．４５１２．４ ８１１．１９１５．９０１０．８５１５．３１１２．１２Σｘ６０．９８１０２．５４６４．９ ５６３．９６６２．１５６１．３４６３．０１６６．２５５８．６２６０３．８ｎ６６６６６６ ６６６５４Ｘ１０．１６．．１７．０９１０．８３．．１０．３６．．１０．２２．．１０．５ ０．．１１．０４．．９．７７．．ΣＸ２６４４．１９１８３５．２０８１５．６０６７９．１ ３６７３．６８６９４．７８７０７．８８７５９．０３６１６．７５７４４４．２４＊＊：Ｐ＜ ０．０１Ｐ与对照组比较附图上清与沉淀溶酶体中酸性磷酸酶总活性比值＊＊Ｐ＜０．０１Ｐ与对 照组比较３讨论３．１溶酶体在胰腺炎发病学中的作用溶酶体是体细胞中重要的细胞器，参与细胞 的消化、防御、调节分泌细胞活动等重要生理过程。在病理情况下，它是组织细胞损伤的直接原因 之一。多种致病因素可以使溶酶体膜透性增加，脆性加强及至破碎、释出溶酶体酶、导致缰胞自身 消化、组织变性、坏死。在ＡＰ的发病机制中“自身消化”学说历来为人们所重视。Ｓｔａｎｄｆ ｉｅｌｄ〔６〕等学者通过对ＡＰ病人Ｎ—乙酰—β—葡萄糖酰胺酶、苹果酸脱氢酶和乳酸脱氢酶 等三种标志酶的测定来检测病人溶酶体膜、线粒体膜和细胞膜的破坏程度，以判断ＰＧＥ２的作用 ，结果发现ＡＰ时胰腺细胞膜系不稳定而ＰＧＥ２具有防止和减轻胰腺细胞膜系不稳定的作用，进 而认为ＡＰ时胰酶在细胞内活化并向局部及全身释出，其根本变化为细胞膜系不稳定所致。Ｓｔｅ ｅｒ等提出酶原的胰内激活可通过溶酶体水解酶的作用在腺细胞内发生〔７〕。以上两位学者的研 究表明在ＡＰ的发病学中溶酶体膜稳定性至关重要。本实验就溶酶体膜稳定性的研究表明、ＡＰ大 鼠胰腺泡细胞溶酶体标志酶—ＡＣＰ释出量比正常组显著增加，提示ＡＰ时溶酶体膜稳定性降低， 这与Ｓｔａｎｄ－ｆｉｅｌｄ的研究相一致。３．２茵陈蒿汤及其组分对ＡＰ溶酶体膜的保护作用 ＡＰ是我国最常见的胰腺疾病〔８〕，其中ＡＰ的死亡率为１０％—２０％〔６〕，而急性出血性 胰腺炎死亡率为８０％—９０％〔９〕。但至今尚无理想的治疗药物〔６〕〔１２〕。以往一些学 者用抑制活性消化酶的药物〔１０〕或者通过抑制胰腺外分泌的“静息”疗法〔１１）治疗ＡＰ， 疗效都不理想。近年来Ｓｔａｎｄｆｉｅｌｄ等应用细胞膜系稳定剂ＰＧＥ２，阻止细胞内激活的 胰活性消化酶释出，从而减轻了对胰腺组织的破坏，明显提高了实验性ＡＰ大鼠的存活率〔６〕。本实验结果表明：茵陈蒿汤及其组分对ＡＰ大鼠均有显著降低ＡＣＰ释放的作用，提示它们增加了溶酶体膜的稳定性对溶酶体膜有保护作用。结合以往的研究〔１〕〔２〕〔３〕〔４〕〔５〕，我们认为茵陈蒿汤及其组分对实验性ＡＰ有治疗作用。而有关其对实验性ＡＰ的死亡率的影响及临床
More abstracts about the 茵陈蒿汤对急性胰腺炎胰腺泡溶酶体膜稳定性的影响