生态制品的冻干及保护剂的应用卫生部上海生物制品研究所上海２０００５２姚祖华李亦德生态制品 主要由活微生物组成，用于制备生态制品的微生物通常有：双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、酵母菌、 大肠杆菌、腊样芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、类杆菌等。生态制品按其剂型可分为液体型和冻干型， “药”字号生态制品要求比较高，而冻干能最大程度地保持微生物的活性，故采用冻干型。目前， 国际上每年举行一次冻干学术研讨会，先进的实验室如荷兰ＳＶＭ冻干实验室已将冻干与显微技术 相结合。因此，冻干引起的损伤及保护剂的应用就必然引起人们的高度重视。１冻干对微生物的损 伤微生物经过冷冻干燥后细胞损伤的主要原因是冰晶形成、盐浓度改变、细胞膜透性改变和代谢作 用损伤。微生物的冻干，必须经历冻结过程。许多生物材料，水占其成分的７０—８０％。这些生 物材料中水变成冰的现象，称做冻结。这是一个物理学的状态变化，同时还伴随着化学变化。这些 变化，将使受冻结的生物材料受到影响，如生物活性的降低和细胞的死亡。曾就酵母及大肠菌的细 胞水份与冻结水份的研究结果表明，若以全湿菌体量为１００，则酵母的细胞水份与冻结水份为７ ６％和６９％，大肠菌为７６％和６９％，少部分水份不论如何降低温度也不能冻结，称“不冻结 水”或“结合水”，即与蛋白质结合的水，其余９０％多的水份叫做“冻结水份”或“自由水”， 即溶解电能质的水。低温对微生物的影响，由于生物材料中形成的冰晶引起的物理变化是主要原因 ，而并非低温本身的原因。还有一个“慢冻”与“快冻”的现象。慢冻，首先是细胞周围的媒介液 冻结，随着温度降低而形成冰，则细胞内的水逸出，细胞逐渐收缩，以后再降止更低的温度，细胞 内也不会形成象冰晶那样的东西。与此相反，快冻时，细胞外形成冰，同时细胞内也形成冰，其冰 粒根据冷却速度而不同，冷冻越快，冰粒就越小，粒数就越多，冷冻速度与细胞的冻结现象或损伤 之间的关系因细胞的种类而不同。Ｎｅｉ等在探讨脱水与活存率的关系中，首先观察了含水份１８ ％的干燥菌体的活存率，结果为８０％左右，与单是冻结融化的对照相比较，大体相等，这说明细 胞水份中单是自由水的干燥，几乎不影响细胞的生死。进一步用这个材料为原始材料进行再干燥， 直至脱干结合水之后，其残余水量与活存率的关系是：细胞的损伤及其活存率的降低与结合水的干 燥程度呈平行关系。Ｎｅｉ为了解单个细胞的脱水状况，利用特殊的喷雾冷冻装置在电子显微镜下 直接观察了冻干过程。将酵母细胞作试验材料，当细胞周围的冰升华后，稍高一会就转入细胞内部 的脱水，干燥是由细胞边缘部分逐步向中心部分进行的，这证实了细胞膜对于水份的通过是起一定 程度的阻滞作用的。在细胞自由水的脱水差不多结束的时候，细胞稍微收缩起来，这可能是由于结 合水的脱水所致。冻干制品中的水份与微生物生死的关系对于冻干后的保存是个重要条件。作为大 体标准，认为１—３％左右时，保存效果最好。冻干的损伤，首先必须建立防止冰晶的形成以及脱 水造成的损害对策。还需考虑一个重要因素——
保护剂。保护剂的性质可影响微生物在冻干过程中 引起的非致死性损伤。２冻干保护剂２．１保护剂的主要功能微生物在冻干及保存过程中，由于细 胞膜破裂、脱水、细胞质浓缩等物理化学原因而死亡。加入保护剂，可以减少这些损害。在冻干溶 介性较低的物质，若溶液浓度太低，则冻干物质在真空升华时，会与水蒸汽一起飞散，或冻干后变 成绒毛状结构，在停止真空后，这种结构的物质就会飞散，因此，冻干前必须在溶液中加入填充保 护剂，使之成形。在需冻干的溶液中加入适量胶体物质，可以防止冻结前溶质沉淀和冻干后发生破 碎。可使制品变得易于冻干，或增加冻干制品的溶介效应。２．２保护剂的要求无免疫原性，无毒 性；冷冻升华时不起泡；冻干后易容介；在冻干和保存过程中有保护作用，有利生物活性的保持； 不影响被冻干制品的检测。２．３保护剂的种类２．３．１保护剂可分为低分子化合物和高分子化 合物，低分子化合物在冻干过程中直接发挥保护作用。制备保护剂时，低、高分子化合物二者结合 就能取得良好效果。还有天然混合物等。低分子化合物：谷氨酸、天门冬氨酸、葡萄糖、蔗糖、肌 醇、精氨酸、赖氨酸等；
高分子化合物：白蛋白、明胶、蛋白胨、可可溶性淀粉、糊精、藻类等； 天然混合物：脱脂牛奶、血清等；其它：抗环血酸、半胱氨酸、等。２．３．２根据升华速度分为 ２类，一类浓度增加时升华速度减低。另一类没有这种浓度增加升华速度减低现象。将上述二类保 护剂结合则增进了升华速度。谷氨酸钠对双歧杆菌的保护在加入了后者保护剂时显著提高。２．３ ．３根据保护剂的功能和性质，可分为：填充剂，防冻剂，
抗氧化剂，酸碱调整剂，缓冲剂，消除 美拉德反应，消除自由基团形成。保护剂的配方因不同的制品而异，一般包括冻干和贮存时的保护 剂、形成团块的胶体、羟基中和剂和干燥缓冲剂。３保护剂的应用保护剂的应用作为常识已为大家 所熟悉，但是，性能较好的保护剂及研究在国内较少。国外在保护剂方面做了大量研究及应用的工 作。双糖—胶体保护剂经过了反复研究和应用，确定了最佳配方。许多作者证实了谷氨酸钠的保护 作用，在保护剂中加入谷氨酸钠，在冻干活微生物制品中提高了稳定性。近年来，海藻糖的保护作 用日益为人们所重视。许多作者对微生物耐高渗环境时细胞质中海藻糖的含量变化作了研究，海藻 糖具有稳定的细胞膜和蛋白质结构的抗逆保护作用。关于抗氧化剂，也有许多作者做过研究，提出 了一些有效的成分。抗氧化剂—双糖—胶体保护剂，经过试验证明能显著提高稳定性，而且不抽真 空也能保存相当时间。笔者在实验室研究时，就发现新的抗氧化保护剂有显著的优点，冻干后活存 数高且保存稳定，在无真空时也比常用保护剂活存数高，这对含活微生物的生态制品是非常重要的 。综上所述，冻干生态制品或多或少含有非致死性细胞，除了冻干方法及保护剂的作用，要恢复这 些细胞，复悬液是非常重要的，许多研究者做了大量工作（将在另文叙述）。在了解了保护剂的性 质和作用的基础上，通过不间断的努力，我们认为对保存高活存率的冻干微生物的发展是可能的， 同时，也将进一步提高生态制品的质量。生态制品的冻干及保护剂的应用$卫生部上海生物制品研 究所@姚祖华@李亦德较少。国外在保护剂方面做了大量研究及应用的工作。双糖—胶体保护剂经 过了反复研究和应用，确定了最佳配方。许多作者证实了谷氨酸钠的保护作用，在保护剂中加入谷 氨酸钠，在冻干活微生物制品中提高了稳定性。近年来，海藻糖的保护作用日益为人们所重视。许 多作者对微生物耐高渗环境时细胞质中海藻糖的含量变化作了研究，海藻糖具有稳定的细胞膜和蛋 白质结构的抗逆保护作用。关于抗氧化剂，也有许多作者做过研究，提出了一些有效的成分。抗氧 化剂—双糖—胶体保护剂，经过试验证明能显著提高稳定性，而且不抽真空也能保存相当时间。笔 者在实验室研究时，就发现新的抗氧化保护剂有显著的优点，冻干后活存数高且保存稳定，在无真 空时也比常用保护剂活存数高，这对含活微生物的生态制品是非常重要的。综上所述，冻干生态制 品或多或少含有非致死性细胞，除了冻干方法及保护剂的作用，要恢复这些细胞，复悬液是非常重 要的，许多研究者做了大量工作（将在另文叙述）。在了解了保护剂的性质和作用的基础上，通过不间断的努力，我们认为对保存高活存率的冻干微生物的发展是可能的，同时，也将进一步提高生态制品的质量。生态制品的冻干及保护剂的应用$卫生部上海生物制品研究所@姚祖华@李亦德
More abstracts about the 生态制品的冻干及保护剂的应用