临床上因服用大剂量镇静催眠药引起中毒的情况时有发生，以巴比妥类药物和苯二氮章类药物较为常 见。据国内文献报道''"''，在用液相色谱法同时测定这两类药物时，多采用单一的流动相洗 脱，由于这两类化合物的极性接近，常常需要强化一些色谱条件，如：增加缓冲液的浓度或升高柱 温等，来提高样品的分离度。但是，这些强化的色谱条件往往容易使泵和柱子发生堵塞，影响仪器 的正常运转。本文采用二元梯度洗脱方式，以甲醇和水作流动相，同时测定了苯巴比妥、安定等7 种常见镇静催眠药的血药浓度；用二氯甲烷提取，样品全部洗脱时间不超过15min，色谱条件 温和，各药物间达到完全分离，并根据仪器可在线扫描之特点，采取保留时间和最大吸收波长同时 定性，获得满意效果。实验方法1仪器与试剂1．1仪器与色谱条件：HP1050液相色谱仪（ 美国惠普）带四元梯度泵，可编程可扫描可见一紫外检测器，HP35900D色谱工作站色谱条 件：HypersilODS柱100x4．6mmID，240urn波长处检测'''，流速 1．oml／min，洗脱条件：在0～7min之内，甲醇的比例由55％递增至65的。光谱 条件：扫描速度sum／s，扫描范围200。400urn。1．2试剂：甲醇（色谱纯），重 蒸馏水，镇静催眠药对照品由中国药品生物制品检定所提供，内标为对工甲氨基苯甲醛（AR）， 其它试剂均为分析纯。2实验步骤2．1标准贮备液的配制：精称一定量的对照品和内标物，用甲 醇配制成ig／L的标准贮备液。2．2样品的处理：取400...血浆（血浆标准品或样品） ，加人SPIN标贮备液，再加200pl＄酸盐缓冲液（pH7．6），振荡，另加ZmlM氯 甲烷，漩涡振荡．离心，取二氯甲烷层溶液lml，40oC氮气吹干，用20（）plr醇重组 ，过滤，取10pl进样，色谱图（略）。2．3线性试验：加一定量的标准贮备液于Zml容量 瓶中，用空白血浆配成0．0、5．0、10．0、25．0、50．omg／L的血浆标准品， 照2．2方法提取，进样，峰面积定量回归得线性方程，同时计算出各药物的分离度，见表1。空 1纷忖柱助力要四分的公民用2．4回收率试验：配制3种浓度为7．sing／L，15mg／ L，30mg／L的血浆标准品，照2．2法提取，测定其含量。以测定量与加人量的百分比计算 其回收率，结果见表2。2．5日内差与日间差：取同一份样品在同一天内测定5次，另外，在不 同天数内5次测定同一份样品，经统计，求得其日内差和日间差．2．6样品的测定：取患者血浆 标本40（）p，加人spiN标贮备液，照2．2方法操作．2．7样品定性：在样品峰出峰前 做背景扫描，当样品出峰后"株洲301厂职工医院宪07种植苏催眼苏加往回收本驻里I＿。门 ＼J＿＿N吸收值大于50mAU时，停泵扫描，扫描范围200～400urn，于最大吸收值 处找出最大吸收波长。各样品峰的定性保留时间与最大吸收波长见表3。韦R各药物的使留时间和 见十m除油井3实验结果见图1。3．1各组分的线性回归方程及回收率见表1、表2。3．2各 药物的最大日内变异为RSD-5．83％（n-5），最大日间变异RSD-9．64％（n- 5）。3．3各药物的定性指标"'，见表3。讨论1最佳色谱条件确定本实验曾采用单一50％ 、60％、70％比例的甲醇进行洗脱发现，巴比妥类药物在甲醇比例较低的情况下，分离效果好 ，但安定的保留时间较长，峰形拖尾严重；随着甲醇比例的增加，巴比妥类药物分离度降低，但安 定的保留时间减短，峰形较为对称。我们以时间和甲醇的比例为两个因素，进行不同的组合，筛选 出最佳洗脱条件：T。0B＝50％；T＝7minB一65％。此时各组分完全分离，安定的保 留时间最短。梯度洗脱是一种比较灵活的洗脱方式，它可以通过控制时问程序，来调整流动相的极 性，使总的分离时间缩短，有效灵敏度得到提高。本实验采用甲醇和水作流动相，对泵和柱子的寿 命几乎没有什么影响。7党性担任的排住在液相色谱中，保留时间可用来作定性指标，但在临床检 测过程中，常出现其它药物干扰的情况，影响结果的准确性、因此，我们利用仪器可进行在线扫描 的功能，采用保留时间和最大吸收波长同时定性，见表3。从表中可看出除了巴比妥类药物最大吸 收波长的难以相互区分外，其它各药物都有各自的特征吸收峰。在对巴比妥类药物定性时，可加人 对照品，以保证结果的可靠性。3其它药物的干扰在实验过程中，我们发现苯妥英、卡马西平和安 眠酮对异成巴比妥、硝基安定、艾司华化的测定有干扰，不能达到完全分离，故未将这几种药列人 含量测定范围。但从表3来看，它们都有各自的特征吸收波长，通过对药物峰进行扫描，仍可将它 们单独区分开来。二元梯度洗脱法快速测定人血浆中7种镇静催眠药浓度@陈萱$湖南医科大学附 属湘雅医院药剂科!410008@钱康年$湖南医科大学附属湘雅医院药剂科!410008@ 谭桂山$湖南医科大学附属湘雅医院药剂科!410008@易贤明$株洲301厂职工医院HP LC;;梯度洗脱;;血浆;;镇静催眠药本文采用二元梯度洗脱法快速测定了人血浆中7种镇静 催眠药的浓度．以二氯甲烷为提取溶剂，色谱测定条件为：HyperSilC18柱，100× 4．6mmI．D，检测波长240nm；流动相为甲醇（B）和水（A），流速1．0ml／m in。洗脱条件：T＝0B＝50％；T＝7minB＝65％。采用保留时间和最大吸收波长同 时定性，在线扫描范围200～400nm，扫描速度5nm／s。全部样品洗脱时间不超过15 min，药物之间达完全分离。7种药物中平均回收率最低的为司可巴比妥，回收率88．24％ ．样品在0～50μg／ml范围内呈良好的线性关系。最大日内差和日间差分别为5．83％和 9．64％。本法提取简单，分离度好，定性方便，非常适用于医院中镇静催眠药中毒患者快速鉴定。1徐玉霞,等.反相HPLC快速测定微量人血清中7种中枢神经抑制药.中国医院药学杂志,1993,13(8):341
2张金泉,等.HPLC同时测定人血清中10种抗癫病及镇静催眠药物.中国药学杂志,1994,29(8):476
3蒋芝荣,等.高效液相色谱法测定人血浆中舒乐安定的浓度.中国医院药学杂志,1991,11(11):488
4刘丽敏,等.计算机辅助简化识别法测定血液及胃容物中12种抗精神药物.中国药学杂志,1996,31(3):157
5卫生部药典委员会.中国药典(二部).1990版.北京:化工出版社、人民卫生出版社,1990
6张仁斌,等编.高效液相色谱─在医药研究中的应用.上诲:上海科技出版社,1983:46大 吸收波长同时定性，在线扫描范围200～400nm，扫描速度5nm／s。全部样品洗脱时间 不超过15min，药物之间达完全分离。7种药物中平均回收率最低的为司可巴比妥，回收率8 8．24％．样品在0～50μg／ml范围内呈良好的线性关系。最大日内差和日间差分别为5 ．83％和9．64％。本法提取简单，分离度好，定性方便，非常适用于医院中镇静催眠药中毒 患者快速鉴定。1徐玉霞,等.反相HPLC快速测定微量人血清中7种中枢神经抑制药.中国医院药学杂志,1993,13(8):341
2张金泉,等.HPLC同时测定人血清中10种抗癫病及镇静催眠药物.中国药学杂志,1994,29(8):476
3蒋芝荣,等.高效液相色谱法测定人血浆中舒乐安定的浓度.中国医院药学杂志,1991,11(11):488
4刘丽敏,等.计算机辅助简化识别法测定血液及胃容物中12种抗精神药物.中国药学杂志,1996,31(3):157
5卫生部药典委员会.中国药典(二部).1990版.北京:化工出版社、人民卫生出版社,1990
6张仁斌,等编.高效液相色谱─在医药研究中的应用.上诲:上海科技出版社,1983:46
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