左归降糖灵对高糖刺激血管内皮细胞反应性变化的影响葛金文喻嵘邓奕辉陈大舜（湖南中医学院名医 名方研究室长沙４１０００７）提要以体外培养的人脐静脉内皮细胞（ＨＶＥＣ）为受试对象，观 察了高浓度葡萄糖（３０ｍＭ）刺激时ＨＶＥＣ的反应性及左归降糖灵的作用。结果表明，高糖组 培养液中葡萄糖浓度下降百分率显著升高，ｖＷＦ含量亦明显增加。在非高糖组，左归降糖灵和达 美康均能促进葡萄糖转化和ｖＷＦ释放。在高糖组，达美康仅能抑制ＨＶＥＣ释放ｖＷＦ，而左归 降糖灵则不仅能显著抑制ｖＷＦ释放，还能明显地促进葡萄糖转化。提示左归降糖灵在降低血糖的 同时，对糖尿病血管并发症可能有防治作用。关键词左归降糖灵；达美康；高糖；血管内皮细胞； 血管性假血友病因子糖尿病血管病变是糖尿病最常见的并发症，这种血管并发症与高糖血症密切相 关［１，２］，但高糖血症诱导血管病变发生的机制目前尚不清楚。近年血管内皮损伤在血管病变 中的作用日益受到重视，从血管内皮细胞（ｖａｓ－ｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌ ，ＶＥＣ）功能的改变来探讨糖尿病血管并发症的发生机制已成为该领域研究的重要课题。左归降 糖灵在防治糖尿病方面具有较好的作用［３］，本研究从高浓度葡萄糖刺激ＶＥＣ反应性变化的角 度探讨了左归降糖灵防治血管并发症的作用。１材料与方法１．１药物左归降糖灵（ＺＧＪＴＬ） 由左归饮加减并经正交试验筛选而成。药材购自本院杏林药号，鉴定为正品，经水煎、冷藏、高速 冷冻离心及灭菌后备用。达美康（ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）为天津华津制药厂生产，批号９６０５３ ３。１．２血管内皮细胞培养参照Ｊａｆｅ［４］略作改进。新鲜脐带在无菌条件下以Ｄ－Ｈａｎ ｋ′ｓ液（ＮａＣｌ８．０ｇ，ＫＣｌ０．４ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４·Ｈ２Ｏ０．０６ｇ，ＫＨ２Ｐ Ｏ４０．０６ｇ，ＮａＨＣＯ３０．３５ｇ溶于１０００ｍｌ三蒸水）洗净表面血迹并冲洗脐静脉 直至冲出液无色澄明为止，然后用０．２５％胰蛋白酶（Ｓｉｇｍａ公司产品）溶液适量注入脐静 脉，３７℃消化１５分钟，消化液中加入适量小牛血清（杭州四季青生物材料研究所生产）以中止 胰蛋白酶反应，８００ｒｐｍ离心１０分钟，弃上清，沉淀加入ＲＰＭＩ１６４０完全培养基（ １０００ｍｌ含ＲＰＭＩ１６４０干粉１０．４ｇ、ＮａＨＣＯ３２．０ｇ、ＨＥＰＥＳ２．９７ ５ｇ、青霉素１００万ｕ，链霉素１００万ｕ，并加入２００ｍｌ小牛血清）悬浮细胞，计数，调 整细胞密度为３０万个／ｍｌ，然后接种于２４孔细胞培养板（ＧＩＢＣＯ公司产品），每孔０． ５ｍｌ，置５％ＣＯ２、９５％氧气的ＣＯ２培养箱（Ｓｈｅｌｔｏｎ公司产）３７℃培养，１２ 小时后换液一次，以后４８小时换液一次，一般于培养第五天细胞融合成片，此时可用于后继试验 。培养细胞经形态学和免疫学鉴定为ＶＥＣ。１．３试验方法融合生长的ＶＥＣ换成不含小牛血清 的ＲＰＭＩ１６４０基础培养基，每孔０．４８ｍｌ，然后随机分为６组，其中３组每孔加入１０ μｌ１５Ｍ葡萄糖液使终浓度为３０ｍＭ，再分别加入Ｄ－Ｈａｎｋ′ｓ液（空白对照组）、达美 康或左归降糖灵（观察组）１０μｌ，使达美康、左归降糖灵的终浓度分别为３３．３３μｇ／ｍ ｌ和１．４０ｍｇ／ｍｌ；另３组以等量Ｄ－Ｈａｎｋ′ｓ液代替１５Ｍ葡萄糖液，同上加入上述 三药，３７℃继续孵育３小时，然后收集条件培养液，离心３０００ｒｐｍ１０分钟后，用葡萄糖 氧化酶法测葡萄糖含量，用夹心酶联免疫法（苏州医学院血栓室）测血管性假血友病因子（ｖＷＦ ）。２结果２．１左归降糖灵对ＨＶＥＣ转化葡萄糖的影响如图１所示，ＨＶＥＣ经基础培养基培 养３小时后葡萄糖转化率为３．０２±２．５（％），达美康和左归降糖灵使糖转化率显著增多， 但两者之间差异无显著性（Ｐ＞０．０５）；而ＨＶＥＣ经３０ｍＭ葡萄糖孵育３小时后，糖转化 率显著性升高（Ｐ＜０．０５），在此基础上，达美康作用不明显而左归降糖灵可使转化率进一步 升高（Ｐ＜０．０５）。图１ＨＶＥＣ对葡萄糖的转化表１对ＨＶＥＣ释放ｖＷＦ的影响（ｘ±Ｓ Ｄ）组别基础培养基（ｕ／ｍｌ）（３０ｍＭ）葡萄糖（ｕ／ｍｌ）对照１９．３２±１５．１６ ５２．３８±１８．３２达美康４２．６３±２５．６８３１．２１±２２．９９△左归降 糖灵６４．２０±２６．５７２９．３４±１６．６２△△ｎ＝８，与基础培养基对照组比较 Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１；与高糖对照组比较△Ｐ＜０．０５，△△Ｐ＜０．０１２． ２左归降糖灵对ＨＶＥＣ释放ｖＷＦ的影响如表１所示，基础培养基孵育３小时左归降糖灵和达美 康使ｖＷＦ释放均显著性增加，高浓度葡萄糖刺激后，ｖＷＦ释放亦显著性增多，但左归降糖灵和 达美康对高糖诱导的ｖＷＦ释放均具有明显的抑制作用。３讨论本研究表明血管内皮细胞在高糖环 境下对葡萄糖的转化明显升高，并能显著地增加培养液中ｖＷＦ的含量，而左归降糖灵在促使葡萄 糖进一步转化的同时，能明显抑制ＶＥＣ分泌释放ｖＷＦ，提示左归降糖灵对ＶＥＣ功能具有较好 的调节作用。ＶＥＣ是单层铺衬于血管内壁、起阻隔血液与血管壁的屏障。近二十年来，ＶＥＣ的 研究取得了很大进展，相继发现它通过分泌一系列的生物活性物质ＰＧＩ［５］２、ＥＤＲＦ［６ ］、ＥＴ［７］及ｖＷＦ［８］参与炎症及免疫反应、肿瘤转移、血栓形成、血管壁病变等病理反 应，Ｓｃｈａｒｆｅｔｅｒ认为ＶＥＣ是血管病变的病理关键部位［９］。糖尿病血管病变在很大 程度上正是由于高糖血症引起ＶＥＣ损伤或功能改变而形成［１０～１２］。本研究结果提示，高 糖引起ＶＥＣ合成释放ｖＷＦ增多，表明ＶＥＣ可能从以抗血栓功能为主状态转入到促血栓形成为 主的激惹状态或损伤状态，这为认识糖尿病血管并发症的发生机制提供了重要依据。达美康为治疗 糖尿病的代谢及血管功能紊乱的药物，除对血糖具有较好的控制作用外，对微血管病变具有特殊作 用，能纠正纤维蛋白溶解及血小板粘附性和聚集性的异常，本研究结果显示达美康能抑制高糖引起 的ｖＷＦ释放，进一步证明了达美康对血小板粘附的抑制作用，因ｖＷＦ是血小板粘附于血管壁的 必要的桥梁物质。左归降糖灵由熟地、枸杞、黄芪、蒲黄等药物组成，具有益气、养阴、活血之功 效，临床研究表明该方具有良好的疗效［１３］。本研究结果显示，除能进一步促进葡萄糖转化外 ，还能显著抑制高糖诱导ＶＥＣ释放ｖＷＦ，提示该方对ＶＥＣ抗血栓功能具有明显的作用，有望 发展成为治疗糖尿病血管并发症的有效中药制剂。参考文献１ＷｉｌｉａｍｓｏｎＪＲ，Ｃｈａｎ ｇＫ，ＦｒａｎｇｏｓＭ，ｅｔａｌ．Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃｐｓｅｕｄｏｈｙｐｏｘｉ ａａｎｄｄｉａｂｅｔｉｃｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９３；４２ ∶８０１２ＣｅｒｉｅｌｏＡ．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｄｉａｂｅｔ ｅｓｍｅｌｉｔｕｓ：Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｈｙｐｅｒｇｌｙｃａｅｍｉａａｎｄｔｈｅｒａｐ ｅｕｔｉｃｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１９９３；３６∶１１１９３陈大 舜，易发银，葛金文，等．左归降糖灵对实验性糖尿病的防治作用．湖南中医学院学报，１９９５ ；１５（２）∶４４４ＪａｆｅＥＡ，ＮａｃｈｍａｎＲＬ，ＢｅｃｋｅｒＣＧ，ｅｔａｌ．Ｃｕ ｌｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｕｍｂｉｌｉ ｃａｌｖｅｉｎｓ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，１９７３；５２∶２７４５５ＤａｖｉｄｓｏｎＥ Ｍ．Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ（ＰＧＩ２）：Ａｐｏｔｅ－ｎｔｉａｌｍｅｄｉａｔｏｒｏｆｉ ｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．ＢｒＪＰｈａｒ－ｍａｃｏｌ，１９７８；６４∶４３７６Ｐａｌｍｅ ｒＲＭＪ，ＡｓｈｔｏｎＤＳ，ＭｏｎｃａｄａＳ．Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｆｒｏｍＬ－ａｒｇｉｎｉｎｅＮａｔｕ ｒｅ（Ｌｏｎｄ），１９８８；３３３∶６６４７ＲｕｂａｎｙｉＧＭａｎｄＰａｒｋｅｒ－Ｂｏ ｔｅｌｈｏＬＨ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｓ．ＦＡＳＥＢＪ，１９９１；５∶２７１３８Ｓａｄｌ ｅｒＪＥ．ｖｏｎＷｉｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９１；２６６∶ ２２７７７９ＳｃｈａｒｆｆｅｔｅｒＫ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｔｉｃｋｅｙｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ：ｔｈｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌ．ｓｅｒｕｍｄｅｐｅ ｎｄｅｎｔｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ ｉｎｏｂｌｉｔｅｒａｔｉｖｅａｎｇｉｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｖａｓａ，１９８６；１５（１） ∶３４１０ＣｏｈｅｎＭＰ．Ａｌｄｏｓｅｒｅｄｕｃｌａｓｅ，ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒｍｅｔａ ｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１９ ８６；３５∶５５１１夏朴，ＫｉｎｇＧＬ．高血糖对血管细胞内信息传导的影响———糖尿病血 管并发症发病机制的探讨．中华内分泌代谢杂志，１９９６；１２∶２２２１２ＡｒｉｍａＳ，Ｉ ｔｏＳ，ＯｍａｔａＫ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅａｕｇｍｅｎｔｓａｎｇｉｏｔｅ ｎｓｉｎⅡａｃｔｉｏｎｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＮＯｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｉｎｖｉｔｒｏ ｍｉｃｒｏｐｅｒｆｕｓｅｄｒａｂｂｉｔａｆｅｒｅｎｔａｒｔｅｒｉｏｌｅｓ．ｋｉｄｎｅ ｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９５；４８∶６８３１３易发银，陈大舜，葛金文，等．左 归降糖灵治疗糖尿病３３例．湖南中医学院学报，１９９６；１６（２）∶２１ＥｆｅｃｔｏｆＺＧＪＴＬｏｎＶａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌＲｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏＨｉｇｈＧｌｕｃｏｓｅＧｅＪｉｎｗｅｎ，ＹｕＲｏｎｇ，ＤｅｎｇＹｉｈｕｉ，ｅｔａｌ．（ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＦａｍｏｕｓＤｏｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒＦｏｒｍ
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