中药药理研究实验设计浅析

中药药理研究实验设计浅析方文贤（中国中医研究院中药研究所北京１００７００）中药药理研究实 验设计是否科学、合理、先进，是关系到中药药理研究的目的是不是能够达到、实验是否能够成功 的关键所在。中药药理的实验设计应根据研究的目的和要求进行，既要符合中医药基础理论，又要 符合实验设计的三大原则——重复、随机、对照；既要保证结果的科学性、正确性、可靠性，又要 减少误差和偏因。关于药理、中药药理有关实验设计的要求和方法，已有不少专著都进行了论述〔 １～４〕。本文只结合在审查和处理有关中药药理研究论文时发现的在中药药理研究实验设计中应 注意的问题进行浅显地分析，以引起对这些问题的重视。１实验动物的选择１．１符合国家标准的 实验动物１９９２年我国卫生部颁布了《医学实验动物标准》，将医学实验动物分为四个等级，一 级：普通动物，二级：清洁动物，三级：无特殊病原体动物，四级：无菌动物〔５，６〕。并制定 了有关环境、设施〔７〕、饲料〔５〕等标准。最近在申报科研成果奖中又规定了对实验动物及实 验环境的要求。因此，在实验设计中必须选择符合实验目的、标准化的实验动物。而不能象有些实 验者那样随便从哪个动物饲养场甚或从自由市场或农民手中购得，用于实验。１．２实验动物的数 量要求为了达到具有重复性的设计要求，实验动物必须达到一定的数量。对于实验指标稳定者，还 要重复２～３次。动物数要根据实验观察指标的性质、动物种类和统计学要求而定。一般认为用小 鼠或大鼠，计量研究每组不少于１０只，计数研究不少于２０～３０只；用豚鼠或家兔的计量研究 ，每组不少于６只；猫或犬的计量研究，每组不少于４～５只〔３〕。但在我们看到的论文中，竟 有小鼠每组用５，６只，兔每组用２，３只的。因为动物数太少，所得数据离散度较大，有的标准 差竟为均数的一半，实验结果根本无法分析。１．３实验动物的种类实验动物种类的选择，主要根 据实验目的、要求及动物特点而定。有些实验指标是不宜选用某种动物的〔１，２〕。但在近年仍 发现有这种问题。如有报告用家兔做降压药理实验的，有研究药物对失血性休克家兔血压影响的。 家兔心血管系统，特别是血压不稳定，一般不适合做心血管药理，特别是血压实验。这也是常识， 却在实验设计时被忽略了。还有以小鼠体温为指标，观察药物对体温的影响，其结果也极不可靠。 因为正常小鼠上午８００～１０００，体温波动可达０．５～２．０℃左右，以８００左右最高， １０００自行下降，下降１℃者甚普遍，一般１０３０～１５００左右相对恒定些，但也往往有０ ．４～０．８℃的波动。由于小鼠体温调节中枢功能不发达，且对药物敏感性反应也不恒定，故一 般不宜以小鼠进行体温实验。还有呕吐实验宜选用犬、猫、鸽子，不宜选用家兔或鼠类（无呕吐反 应）。有人测小鼠血清中调节因子，没有采用纯系鼠，因而个体差异很大，难以说明是药物的作用 还是个体差异；有人作同种皮肤排斥实验时，没有选用两个不同品系的纯种鼠进行，这样，动物选 择不当，实验就毫无意义。诸如此类都是在实验设计时应引起重视的问题。１．４实验动物的年龄 、体重一般动物都宜选用成年者，除非特殊需要须选用幼年或老年者。如有人用未成年昆明种小鼠 做学习记忆实验，其结果就不可靠。这一实验要求动物是成年小鼠，一般体重在３０ｇ以上（纯系 动物更好）。又如１９８９年全国肿瘤药理及化疗学术会议上制定的《抗癌药物体内药效试验规程 》要求，实体瘤：小鼠体重一般为２０±２ｇ，大鼠体重批内差异不超过±１０ｇ。这些对动物年 龄、体重的要求。都应在实验设计中予以足够重视。１．５实验动物的性别动物的性别对实验结果 也有一定的影响，故在实验设计时也要注意动物的性别要求。一般来说，只用一种性别比两种性别 兼用者所得资料的离散度要小，可靠性要高〔２〕。如溶血素的产生，雌性就易产生，实验时雌雄 不拘，差异大，就会影响结果的可靠性。雌性小鼠有明显的性周期活动，会引起一些生理指标的周 期变化，所以有些实验室要求实验小鼠除必需用雌性者外，一律都用雄性。但如用热板法测小鼠痛 阈，则必须用雌鼠。因温热刺激可使雄鼠阴囊松弛下垂，受烫后易变生惊跳，影响结果的观察。《 抗癌药物体内药效试验规程》中也要求“一批实验中应取同一性别的动物”。２实验方法和指标的 选择一般应选择方法可靠、先进、操作规范，指标结果可信，而又被公认者。在选择实验方法时， 还要注意其敏感性和客观性。对于客观性差、易产生误差和易受主观因素影响的方法，最好避免选 用。如显微镜下计数淋巴转化细胞的形态学方法、细胞毒实验中的镜下计数方法、Ｅ－玫瑰花结试 验的计数方法、脾小结Ｂ细胞密度和吞噬指数的镜下计数方法、抗肿瘤实验中肿瘤“测径”的方法 等等，客观性很差，现已多不采用，而代之以同位素或其他比较客观的方法〔８〕。还有一些方法 虽有其一定缺陷，但在没有更科学、可靠、先进的取代方法之前，仍可以作为初筛方法，或作为其 他实验的一个侧面，或作为补充实验而当作参考方法选用。如小鼠酚红祛痰法，由于方法评价上有 一定问题，因此只用于初筛〔２〕。但有人设计时只用这一方法，结果欲说明药物有祛痰作用，就 不足以令人信服了。３给药时间、途径与剂量的选择３．１给药时间有人在实验设计中，由于没有 注意实验过程中的给药时间，而在动物病理模型造型前给药，一直给到造型后，实验目的却是为了 说明药物对该病的治疗作用，实验设计的不合理是显而易见的。还有人做免疫实验，竟对小鼠给药 ２１天，如不是做抗衰老实验，这么长时间给药，小鼠已成为老鼠，免疫功能已有不少改变，这样 的实验结果恐与实验目的会是大相径庭的。３．２给药途径由于中药大多是水煎剂口服，所以在中 药研究中，也要注意这一特点，尽量选用经口给药法，对于未提纯的粗制剂，更应如此。因此，在 实验设计时，如是粗制剂，应尽可能避免采用注射给药法。我们发现不少实验在用中药粗制剂进行 抗炎、镇痛、镇静等研究时，采用注射给药法，结果不能排除因药物刺激而出现的假阳性，造成结 果无法判定。还有作腹水癌细胞及腹腔渗出物观察时，更应该避免中药粗制剂的腹腔注射给药法。 因为粗制剂可以直接影响观察物，从而造成假阳性。３．３给药剂量在中药药理研究中，给药剂量 的选择应遵循一定的规律。因为中药有其长期临床用药经验的基础，所以在选择实验用药剂量时， 可以参照临床用药剂量根据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表”〔２〕进行折算，并 注明选用相当临床剂量的多少倍。对于有一定毒性或者经过粗提取的中药，在进行药效学研究时， 最好选用ＬＤ５０的１／５～１／２０，按每１ｋｇ体重给药。但在有的论文中见到用１／３ＬＤ ５０剂量进行药效学研究的，特别是进行镇痛、镇静的药效研究，所得实验结果是毒性反应还是药 效就很难判定。另外，还要注意给药体积。对毒性小的中药煎剂或浓缩液，给药的体积也应有一定 限度，药液少达不到药效学的要求，体积过大则动物承受不了。如每只小鼠一次灌胃给药，一般不 超过１ｍｌ。一般来讲，在一定范围内，剂量与药效呈平行关系是药效学的一条基本规律。因此， 观察药物的作用，不仅要说明有没有作用，还应分析剂量同生物效应的关系，如果表现一定的依存 关系，则不仅提供了更多的信息量，而且其结果也更为可信。所以在进行实验设计时，一般都要设 计２～３个剂量组。单独一个剂量组的结果是很难说明问题的。４中药离体实验注意事项用未经纯 化处理的中药粗制剂（中药或中药复方的煎剂、粗提物）进行离体（体外）实验，必须充分估计到 中药粗制剂中的杂质和理化特性对实验结果的影响，如药液的酸碱度、各种电解质和颗粒等。所以 在进行离体实验设计时，首先要考虑所用制剂是否符合离体实验要求。有不少专家指出：中药及其 复方粗制剂的离体实验的科学性，目前未得到承认，因为这种实验结果的可靠性及杂质的干扰程度 无法评价。还有专家直率地指出：用粗制剂进行体外的有关凝血试验，大多是徒劳无益的。并认为 体外抗血小板聚集作用很强的中药提取物不在少数，但２０％的抑制率却几乎等于无作用。离体实 验在设计时还要注意药物的浓度。如抗癌药体外实验结果，据国内有关技术要求的规定，粗品浓度 ＜５０μｇ／ｍｌ，最高限在５０～１００μｇ／ｍｌ，纯品浓度＜１０μｇ／ｍｌ，结果才能算 阳性。浓度太大，则不被接受和承认。所以离体实验的药物浓度应有适当控制。５对照组的设计、 结果统计和结论５．１对照组的设计对照是科研对比的基础，没有比较就难以鉴别，也就缺乏科学 性，所以实验设计必须设立对照组。对照各组应在“同时同地同条件”下进行，否则失去对照意义 。对照组也应根据实验目的、要求和条件设立，一般应设正常对照组、造型对照组、阳性对照组等 几组。正常对照组可比较实验条件对动物的影响，造型对照组可比较正常组说明造型是否成功，阳 性对照组可比较实验用药的药效。有些药物的助溶剂可能影响药效的也要设立溶剂对照组，如乙醇 、吐温－８０等。这些问题看似常识，但在一些论文中常常可以发现对照组设立不全者，所以这里 再强调一下，以引起注意。５．２统计处理和结论实验结果必须经统计学处理后才能得出可信的结 论，这也是科研常识。但有些论文就是不作统计处理就下结论，有些明明统计不过关也要下有“趋 势”的结论。我们说还是实事求是的好，既然有“趋势”，为何不再增加动物数做一个明显差异出 来。还有一些是统计处理方法不对。如有一组实验结果，由于实验前动物个体差异较大，处理后各 组与处理前比较，统计处理均无显著差异，而研究者却用处理后各组间数据进行比较，结果得出有 显著差异，于是就得出了错误的结论。还有实验各组设立正确，而统计对比处理错误，统计结果不能正确得出者，又令人遗憾、感叹。６结语以上只是从５个方面浅要分析了中药药理研究在实验设计时应注意的一些问题，还有很多方面没有涉及。如中药药理研究在实验设计时应符合中医药理论、应结合中医临床实践等。因为中药药理研究是新发展起来的学科，所以有很多问题需要探索、讨