治肝灵抗实验性肝损伤的流式细胞分析甄彦君，孙方军，李陈利，刘芳提要实验采用流式细胞光度术 ，分析了治肝灵对四氯化碳（ＣＣｌ４）所致小鼠肝损伤细胞的影响。结果表明，治肝灵可减轻实 验性肝损伤细胞的变性、坏死，加速肝细胞的ＤＮＡ合成及分裂增殖，具有促进修复，恢复肝功能 的作用。治肝灵为自拟的治疗慢性乙型肝炎的中药方。主要由柴胡、丹参、青风藤、内金等组成。 经临床１００例病人观察，对慢性乙肝有良好疗效。为进一步探讨药物的降谷一丙转氨酶（ＡＩ． Ｔ）、改善肝功能的作用机理，我们观察了治肝灵对（ＣＣＩ。）所致小鼠肝损伤的治疗作用，并 采用流式细胞光度术分析了药物对肝细胞的影响。１实验材料１．１实验动物：健康昆明种小鼠３ ０只，体重１８～２０９，雌雄各半，由河北省实验动物中心提供。１．２实验药品；：Ｔ治肝灵 水煎液，浓缩成２００％的药汁备用，由河北省中医药研究所提供。②四氯化碳（分析纯），上海 长江化工厂生产，配成０．ｌ％的豆油溶液备用。２方法２．ｌ模型复制及给药方法：将３０只小 鼠随机分成正常对照组，损伤组和治疗组。后两组效实验的第１日起，给每只小鼠腹腔注射１０ｍ ｌ／ｋｇＣＣＩ．豆油溶液。实验的第２日起，治疗组开始给药，按２７ｍｇ／ｇ／日灌胃，其他 两组给等量自来水。２．２病理组织学及流式细胞样品制各：连续给药一周后，将３组动物同时处 死，分别取样．①放肝左叶取材，１０％甲醛固定，石腊切片，ＨＥ紫色，ＯｌｇｍＰｕｓ显微镜 观察；②另取损伤组和治疗组肝组织，７０％的乙醇固定，剪碎至ｌｍｍ’大小，依次１００％， ９５％，８０％，７０％和５０％的酒精中水化，每次１０ｍｉｎ，经蒸馏水浸洗３次，每次ｓｍ ｉｎ，然后置于１００目铜网上轻搓，并以生理盐水漂洗３次，每次１０００ｒ／ｍｉｎ，离心２ 分钟，弃去上清，７０％乙醇固定，待检。③ＤＮＡ染色方法，用溪化乙院荧光染料（澳化乙院１ ０Ｕｇ；ｍｌ·ＲＮＡ酶２０ｐｇ／ｍｌ，Ｔｒｉｏｎｘ１０００．１Ｘ），在０～４”Ｃ冰箱中 进行ＤＮＡ染色，３０ｍ。ｎ后即可上机检测。河北省中医药研究所河北医学院２．３检测方法： 使用美国ＢＤ公司生产的ＦＡＣＳ—一４２０型流式细胞仪进行检测，实验图形及数据输人ＨＰ— —３００Ｃｏｎｓｏｒｔ３０型计算机进行数据处理，采用Ｂａｒｌｏｇｉｅ的细胞图解法分析， 将处于不同时期的细胞分为三部分，即：Ｇ。八期、Ｓ期、Ｇ。Ｍ期。根据ＤＮＡ含量组方图，由 计算机算出各时相的分布比率，并计算细胞增殖指数（ＰＩ），分式为：３实验结果：３．１病理 组织学观察：①正常对照组，肝小叶结构清晰，肝细胞索放射状结构明显，肝窦无扩张、淤血或狭 窄，肝细胞内颗粒均匀，间质及．ｌ脉区无炎细胞浸润。②损伤组，肝小叶结构不清，中央静脉扩 张淤血，肝细胞索排列紊乱，肝窦狭窄或消失。肝细胞体积明显增大，呈不同程度的颗粒样变性， 严重者胞浆浅染，疏松呈网状，弥漫性的空泡变性。小叶内可见散在的小灶性坏死，小叶间及汇管 区内有不等量的单核及淋巴细胞浸润。③治疗组，肝小叶界限清楚，中央静脉无充血，放射状细胞 索可见，未见坏死灶，间质内少量炎细胞，可见再生的肝细胞．３．２流式细胞仪检测分析：①损 伤组ＳＮ肝细胞ＤＮＡ含量组方图均以Ｇ。八期细胞为主峰，Ｓ期峰位低平，Ｇ。Ｍ期峰位不明显 ．（见图１）②治疗组８例，肝细胞ＤＮＡ含量组方图显示，虽以Ｇ。八期细胞为主峰，但峰值明 显低于损伤组，而Ｓ期峰段明显抬高，并出现了清楚的Ｇ。Ｍ期细胞峰。（见图２）③对照组与治 疗组肝细胞增殖时相比率见表１。表Ｉ两组肝细胞增油时相比享（二士。）冶疗组与损伤组比较： 。ＰＭＯ．０５，。。ｐＭＯ．００５结果显示，治疗组Ｇ。八期细胞百分率明显低于损伤组，而 Ｓ期和ＧＺＭ期显著高于损伤组．三时相分别比较，均有高度显著性差异，【’一｝０５Ｊ’Ｍ０ ．００５。①肝细胞增殖指数对比如表２所示，治疗组肝细胞的增殖指数明显高于损伤组，两组比 较有极显著性差异，表明治疗组细胞增殖速度高于损伤组．４讨论本实验采用先进、可靠、精确的 定量细胞学技术——流式细胞光度术，分析了治肝灵对ＣＣＩ．所致小鼠实验性肝损伤的影响。肝 细胞增殖周期中各时相比率及增殖指数对比表明，损伤组肝细胞物质代谢出现障碍，表现为肝细胞 的颗粒样变性、胞质疏松及空泡变性，以及灶性坏死，从而导致肝细胞的ＤＮＡ合成减慢，静止期 细胞居多，增殖期细胞减少，肝组织的再生和修复能力减弱，而治疗组肝细胞增殖周期中，Ｇ。八 期细胞峰值明显低于损伤组，说明肝组织中静止期细胞明显减少，而Ｓ期和Ｇ。／Ｍ期细胞显著增 多，非增殖型细胞向增殖型转化，这是用药后ＤＮＡ合成加快，分裂能力增强的结果’“。两组细 胞增殖指数对比分析，与上述结果一致。组织学变化表明，治疗组肝细胞变性坏死消失，可见再生 肝细胞，进一步证实用药后肝组织抗损伤及修复能力增强，从形态学角度支持了流式细胞检测结果 。实验表明，治肝灵能促进受损伤肝细胞的ＤＮＡ合成，加速细胞的分裂增殖，减轻肝细胞的变性 坏死，抑制炎症反应，具有明显的抗损伤、促修复的作用。方中柴胡、丹参、青风藤可能起着主药 效应。ＣＣＩ。损伤肝细胞的机导为自由基损伤”‘。柴胡具有明显的抗肝损伤的作用，表现在能 减轻肝细胞的气球样变和坏死”’，这可能和柴胡所含皂成有关，通过降低肝中的过氧化脂质的含 量，抑制氧化反应，减少自由基对肝细胞的损伤”’。丹参能减少损伤时的自由基的形成”‘，与 柴胡的作用相协同。值得提及的是，青风藤所以能够抗损伤，实验证明，主要是对免疫功能有较强 的抑制作用和抗炎作用’‘’，以此减轻肝损伤过程中免疫调控失常的淋巴细胞反应。ＡＬＴ的变 化直接反应肝细胞的坏死程度，本实验研究及临床观察均证实，治肝灵能明显地降低小鼠和人的血 清＊＊Ｔ，改善肝功能，说朗药物对人体肝组织具有同样的抗损伤作用。动物实验与临床研究结果 一致，为临床用药提供了可靠的实验依据。但实验性肝损伤与人体的乙型肝炎有着病因、病机等方 面的不同，故药物作用机理有待进一步研究。参考文献｜｜［１］甄彦君，等．加味玉屏风散对小 鼠脾淋巴细胞增殖影响的流式细胞分析．河北医学院学报１９９３；（２）：８０［２］李廷利， 等．长白柴胡皂甙α对小鼠实验性肝损伤保护作用的实验研究．中医药学报１９８８；（１）：４ ３［３］马学惠，等．逍遥冲剂对实验性肝硬化的防治作用．中草药１９９０；２１（１１）：２ ８［４］王宝恩，等．活血化瘀中药复方对实验性肝纤维化的疗效观察．中草药１９９０；２１（ ４）：２３［５］李嗣英，等．青藤碱对小鼠免疫功能的影响．中草药１９９２；２３（２）：８ １治肝灵抗实验性肝损伤的流式细胞分析@甄彦君，孙方军，李陈利，刘芳$河北省中医药研究所 ，河北医学院实验采用流式细胞光度术，分析了治肝灵对四氯化碳（ＣＣｌ４）所致小鼠肝损伤细 胞的影响。结果表明，治肝灵可减轻实验性肝损伤细胞的变性、坏死，加速肝细胞的ＤＮＡ合成及 分裂增殖，具有促进修复，恢复肝功能的作用。［１］甄彦君，等．加味玉屏风散对小鼠脾淋巴细 胞增殖影响的流式细胞分析．河北医学院学报１９９３；（２）：８０［２］李廷利，等．长白柴 胡皂甙α对小鼠实验性肝损伤保护作用的实验研究．中医药学报１９８８；（１）：４３［３］马 学惠，等．逍遥冲剂对实验性肝硬化的防治作用．中草药１９９０；２１（１１）：２８［４］王 宝恩，等．活血化瘀中药复方对实验性肝纤维化的疗效观察．中草药１９９０；２１（４）：２３ ［５］李嗣英，等．青藤碱对小鼠免疫功能的影响．中草药１９９２；２３（２）：８１Ａ合成， 加速细胞的分裂增殖，减轻肝细胞的变性坏死，抑制炎症反应，具有明显的抗损伤、促修复的作用 。方中柴胡、丹参、青风藤可能起着主药效应。ＣＣＩ。损伤肝细胞的机导为自由基损伤”‘。柴 胡具有明显的抗肝损伤的作用，表现在能减轻肝细胞的气球样变和坏死”’，这可能和柴胡所含皂 成有关，通过降低肝中的过氧化脂质的含量，抑制氧化反应，减少自由基对肝细胞的损伤”’。丹 参能减少损伤时的自由基的形成”‘，与柴胡的作用相协同。值得提及的是，青风藤所以能够抗损 伤，实验证明，主要是对免疫功能有较强的抑制作用和抗炎作用’‘’，以此减轻肝损伤过程中免 疫调控失常的淋巴细胞反应。ＡＬＴ的变化直接反应肝细胞的坏死程度，本实验研究及临床观察均 证实，治肝灵能明显地降低小鼠和人的血清＊＊Ｔ，改善肝功能，说朗药物对人体肝组织具有同样 的抗损伤作用。动物实验与临床研究结果一致，为临床用药提供了可靠的实验依据。但实验性肝损 伤与人体的乙型肝炎有着病因、病机等方面的不同，故药物作用机理有待进一步研究。参考文献｜ ｜［１］甄彦君，等．加味玉屏风散对小鼠脾淋巴细胞增殖影响的流式细胞分析．河北医学院学报 １９９３；（２）：８０［２］李廷利，等．长白柴胡皂甙α对小鼠实验性肝损伤保护作用的实验 研究．中医药学报１９８８；（１）：４３［３］马学惠，等．逍遥冲剂对实验性肝硬化的防治作 用．中草药１９９０；２１（１１）：２８［４］王宝恩，等．活血化瘀中药复方对实验性肝纤维 化的疗效观察．中草药１９９０；２１（４）：２３［５］李嗣英，等．青藤碱对小鼠免疫功能的 影响．中草药１９９２；２３（２）：８１治肝灵抗实验性肝损伤的流式细胞分析@甄彦君，孙方 军，李陈利，刘芳$河北省中医药研究所，河北医学院实验采用流式细胞光度术，分析了治肝灵对 四氯化碳（ＣＣｌ４）所致小鼠肝损伤细胞的影响。结果表明，治肝灵可减轻实验性肝损伤细胞的 变性、坏死，加速肝细胞的ＤＮＡ合成及分裂增殖，具有促进修复，恢复肝功能的作用。［１］甄彦君，等．加味玉屏风散对小鼠脾淋巴细胞增殖影响的流式细胞分析．河北医学院学报１９９３；（２）：８０［２］李廷利，等．长白柴胡皂甙α对小鼠实验性肝损伤保护作用的实验研究．中医药学报１９８８；（１）：４３［３］马学惠，等．逍遥冲剂对实验性肝硬化的防治作用．中草药
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