中图法分类号Ｒ９７９．５环孢素Ａ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ，ＣｓＡ）是一种来自真菌的环十 一肽，临床上广泛用于器官移植后抗排异反应，近来也用于一些自身免疫性疾病的治疗。环孢素Ａ 亲和素（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ，ＣｙＰ）是细胞内ＣｓＡ主要结合蛋白，其氨基酸序列进化非 常保守。据其保守程度推算，至少六亿年前就存在着ＣｙＰ。经过漫长年代的演变和进化，ＣｙＰ 始终广泛存在于各种细胞内，担当着管家基因（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｇｅｎｅｓ）产物的角 色。ＣｙＰ具有肽基脯氨基顺反异构酶（ＰＰＩａｓｅ）活性，在体内外能结合蛋白质并催化加速 它们的折叠、装配和转运，起分子伴娘（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）的作用〔１〕。虽然ＰＰＩａｓｅ 活性可被ＣｓＡ抑制，但这并不足以解释ＣｓＡ就是以此介导其免疫抑制作用。相反，两者之间并 没有直接的联系。当ＣｓＡ进入细胞后，ＣｙＰ与之结合并作用于钙离子、钙调素（ｃａｌｍｏｄ ｕｌｉｎ，ＣａＭ）依赖的神经钙蛋白（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ，ＣＮ），使其失去磷酸化酶活 性，一些核因子不能被去磷酸化，ＩＬ－２等细胞因子的转录受阻，从而抑制Ｔ细胞增生，引起免 疫抑制。⒇按ＣｙＰ在细胞中的分布和氨基酸序列等特征，大体将ＣｙＰ分为三种，即ＣｙＰＡ， ＣｙＰＢ和ＣｙＰＣ。它们的基因分别都已被克隆并体外表达〔２，３〕。在体内ＣｙＰ三种形式 的差别表达对自身免疫性疾病的研究和器官移植的排异监控具有临床应用意义。下面就ＣｙＰ的生 物学特性以及它介导的ＣｓＡ免疫抑制作用机理等方面进行综述。１ＣｙＰ的生物学特性１．１Ｃ ｙＰＡ位于胞浆，是ＣｓＡ的主要结合蛋白。从原核生物细菌到人类，ＣｙＰＡ广泛存在并且高度 保守。自１９８４年Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ等〔４〕从牛胸腺中提取得到ＣｙＰＡ以后， 人们陆续从不同种属各种组织和器官中分离获得ＣｙＰＡ〔５，６〕，使之发展成为ＣｙＰ中最大 的家族。ＣｙＰＡ分子量约１８０００，具有主要和次要两种形式，等电点分别为碱性（ｐＨ＞８ ．０）和中性ｐＨ７．０～）。在不同组织和器官中，ＣｙＰＡ含量不等，两种ＣｙＰＡ比例也不 尽相同。在人类正常组织中，大脑皮层ＣｙＰＡ含量最高，浓度达２．８μｇ／ｍｇ蛋白；皮肤中 较低，含量为０．８μｇ／ｍｇ蛋白〔６〕；在鼠脑中，次要形式ＣｙＰＡ约为主要形式的一半， 在鼠胸腺中，却不含次要形式ＣｙＰＡ。Ｓｃｈｎａｉｄｅｒ等〔２〕应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交 证实人组织中ＣｙＰＡｍＲＮＡ水平从高到低顺序为胰脏＞肺＞骨骼肌＞肾脏＞肝脏＞心脏。最近 有人利用特异性Ｃｙ－ＰＡ抗体，测得全血中ＣｙＰＡ含量为３．４μｇ／ｍｌ，血浆中不含Ｃｙ ＰＡ〔７〕。在进化上，ＣｙＰＡ十分保守。人和牛ＣｙＰＡ氨基酸组成很相似，它们Ｎ端７２个 氨基酸完全一致。来自不同物种和组织的ＣｙＰＡ也显示抗原相似性。兔抗牛ＣｙＰＡ抗体能专一 地结合人和鼠甚至海绵细胞ＣｙＰＡ。虽然Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交显示在人类和大鼠基因组中有２ ０多个ＣｙＰ相关基因，但只有一种ＣｙＰｍＲＮＡ被检测到，而且经过高严谨条件下克隆ＣｙＰ 相关基因证实，人和大鼠染色体中，只有一个拷贝的ＣｙＰ基因，其它类似基因均为假基因，带有 点突变、缺失或插入突变〔８〕。应用限制酶消化和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明在高等植物玉 米、蕃茄和芥子类植物染色体上具有２～８个ＣｙＰ相关基因。这些基因仅编码成熟的ＣｙＰ，其 氨基酸组成８３％同源于哺乳类动物ＣｙＰＡ〔５〕。它们是否含有假基因有待于进一步研究。Ｂ ｅｒｇｓｍａ等在低严谨条件下用人ＣｙＰＡｃＤ－ＮＡ为探针，在人ｃＤＮＡ文库中得到一条与 人ＣｙＰＡ７６％同源性的ＣｙＰＤ（也有人称之为ＣｙＰ３）。其Ｎ端带有４２个氨基酸疏水区 。在小鼠和牛线粒体中也分离得到这种蛋白。有人提示ＣｙＰＤ可能是ＣｙＰＡ转录后拼接的结果 。１．２ＣｙＰＢ主要定位于内质网，分子量２２０００，其氨基酸与ＣｙＰＡ具有６４％同源性 。ＣｙＰＢ也是一个大家族，包括人ＣｙＰＢ（ｈＣｙＰＢ），酵母ＣｙＰＢ（ｙＣｙＰＢ），果 蝇ｎｉｎａ基因产物（ｎｉｎａＡ）和大鼠ＣｙＰ样蛋白（ｒＣｙＬＰ）〔９〕。ＣｙＰＢ家族具 有类似的结构，Ｎ端为导向内质网的信号序列，Ｃ端为可变长度的尾巴，中间是核心区，具有Ｃｓ Ａ结合功能和肽基脯氨基异构酶活性。此结构提示ＣｙＰＢ可能是一种分泌型蛋白。ｈＣｙＰＢ的 信号序列为３３个氨基酸，Ｎ尾端长１０个氨基酸，核心区１６５个氨基酸。比较人和酵母ＣｙＰ Ａ及ＣｙＰＢ，ｈＣｙＰＢ与ｙＣｙＰＢ最为接近。这反映人和酵母可能来自共同祖先。在催化加 速蛋白折叠过程中，ｈＣｙＰＢ占ＰＰＩａｓｅ总酶活性的２５％。与ＣｓＡ的亲和力，它比ｈＣ ｙＰＡ高１０倍多。对酵母的研究显示同样的结果。果蝇ｎｉｎａ基因仅表达一种存在于其眼睛中 的蛋白ｎｉｎａＡ，长２３７氨基酸，４０％与脊椎动物ＣｙＰＢ相同。ｎｉｎａ基因的突变产物 能影响感光细胞中视紫红质分子的正确折叠，导致感光细胞的机能障碍。最近有人从人奶和血浆中 分别得到ＣｙＰＢ，另外在其它生物体液和培养基上清液中也发现了ＣｙＰＢ。这更加证实ＣｙＰ Ｂ为一种分泌型蛋白。在血液中，ＣｙＰＢ的含量远远低于ＣｙＰＡ。人全血ＣｙＰＢ含量为０． ２４μｇ／ｍｌ左右，血浆中ＣｙＰＢ含量为０．１５μｇ／ｍｌ左右〔７〕。这些分泌型ＣｙＰ Ｂ必将与细胞膜上靶分子结合，调节细胞生理活动和生物功能。诚然，鸡胚ＣｙＰＢ在体外对其脊 髓细胞轴突具有生长促进作用，一些分泌型ＣｙＰＢ还能引发多形核白细胞和单核细胞的趋化反应 〔１０〕。１．３ＣｙＰＣ是另外一种分泌型ＣｙＰ，分子量２３０００，与ＣｙＰＡ５５．８％ 同源，最初由鼠骨髓衍生的基质细胞克隆而来。天然状态下，ＣｙＰＣ能结合一种７７０００的糖 蛋白（ＣｙＰＣＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎ，ＣｙＣＡＰ），这种结合可被ＣｓＡ阻抑 。ＣｙＰＡ，ＣｙＰＢ却不具此功能，它们不能结合ＣｙＣＡＰ〔２〕。ＣｙＰＣ具有类似ＣｙＰ Ｂ的一级结构。人ＣｙＰＣ核心序列长１４０个氨基酸（总长２１２个氨基酸），与鼠ＣｙＰＣ９ ５％同源。与ＣｙＰＡ和ＣｙＰＢ不同，鼠ＣｙＰＣ的表达有一定的组织特异性，其表达以肾脏为 最高。由此起初推测ＣｓＡ的肾脏毒性可能由ＣｙＰＣ介导〔１１〕。但随后对人体一些组织和细 胞系的研究结果否定了这种推测。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示，在人肾脏中ＣｙＰＣ并不丰富，其 含量低于骨骼肌，胰脏等组织，而且ＣｙＰＣｍＲＮＡ比ＣｙＰＡｍＲＮＡ低１０倍多〔２〕。因 此，ＣｓＡ的肾脏毒性机理还需进一步研究。在与ＣｓＡ亲和力方面，ＣｙＰＣ最低，它比Ｃｙ－ ＰＡ低２倍，比ＣｙＰＢ低２０倍。１．４其它ＣｙＰ除了上述三种ＣｙＰ，应用ＣｓＡ亲和层析 柱还纯化得到一些ＣｙＰ类似的蛋白质，例如大鼠肝细胞膜上的一种分子量２２０００糖蛋白。此 外，Ｋｉｅｆｅｒ等从大鼠肝细胞浆中分离到分子量４００００ＣｙＰ，它能与ＣｓＡ结合并具有 ＰＰＩａｓｅ活性。在人和小鼠的自然杀伤细胞中也发现了一种分子量１６００００蛋白质，其Ｎ 端含有ＣｙＰ类似片段。这些蛋白的功能以及细胞定位尚不清楚〔１２〕。免疫组化也观察到在细 胞核膜和细胞核中存在着ＣｙＰ，它们可能与细胞内信号传导和功能调节有关〔１３〕。２ＣｙＰ 的空间结构核磁共振（ＭＲ）分析表明，ＣｙＰ分子含有三组α螺旋，八组反平行β片层结构〔１ ３〕。经过Ｘ光晶体衍射分析，ＣｙＰ整个分子几乎呈球状，半径约１．７ｎｍ。在Ｅ．ｃｏｌｉ 中，存在阳离子型（外周间质）和阴离子型（胞浆）两种ＣｙＰ（ＣｙＰＡ的两种形式）。抑制它 们的ＰＰＩａｓｅ活性所需ＣｓＡ浓度虽较抑制真核ＣｙＰ高１０００倍，但它们的结构和活性部 位的功能几乎与真核细胞ＣｙＰ一样。野生型Ｅ．ｃｏｌｉＣｙＰ的整个折叠方式与人ＣｙＰ极为 相似。用圆二色性光谱分析，Ｅ．ｃｏｌｉ阳离子型ＣｙＰ含有１７％α螺旋，３４％β片层结构 ，１７％转角，３３％无规卷曲。Ｘ线晶体衍射和ＮＭＲ联合应用显示，ＣｙＰＡ分子ＰＰＩａｓ ｅ酶活性中心就是ＣｓＡ的结合位点。人ＣｙＰＡ８条反平行β片层结构中的３条与ＣｓＡ接触结 合，其中包括Ｐｈｅ－６０，Ｍｅｔ－６１，Ｇｌｎ－６３，Ｐｈｅ－１１３，Ｇｌｕ－１１１， Ａｒｇ－５５，Ｉｌｅ－５７以及Ｔｒｐ－１２１，Ｌｅｕ－１２２，Ｈｉｓ－１２６，Ａｌａ－ １０１，Ａｓｎ－１０２，Ａｌａ－１０３和Ｇｌｙ－７２，Ｔｈｒ－７３等氨基酸，它们从片层 结构的表面向外突出，形成１．０～１．５ｎｍ左右的深沟将ＣｓＡ嵌入其中，好比投币孔中插入 了一枚硬币。３ＣｙＰ介导的ＣｓＡ免疫抑制分子机理ＣｙＰ具有二大功能：①ＰＰＩａｓｅ酶活 性；②与ＣｓＡ结合抑制Ｃａ２＋－ＣａＭ依赖的Ｓｅｒ－Ｔｈｒ磷酸化酶神经钙蛋白（ＣＮ）。 通过ＣｓＡ类似物与ＣｙＰ相互作用研究发现，ＣｙＰ的ＰＰＩａｓｅ酶活性的失去并不与ＣｓＡ 免疫抑制功能成正相关；另外，ＣｙＰ结合ＣｓＡ活性位点处氨基酸突变的实验证实，ＣｙＰ失去 ＰＰＩａｓｅ酶活性并不影响它与ＣｓＡ的结合以及它们的复合物对ＣＮ磷酸化酶活性的抑制。实 验结果表明，ＣｙＰ的ＰＰＩａｓｅ活性与ＣｓＡ免疫抑制作用无关，真正起作用的是ＣＮ，它是 ＣｓＡ－ＣｙＰ复合物的靶蛋白。Ｔ细胞早期活化包括三个步骤：①外来抗原被Ｔ细胞受体（ＴＣ Ｒ）识别；②胞浆信号级联放大最终传递至细胞核；③细胞核内有关基因活化转录。最后细胞内Ｃ ａ２＋浓度升高，ＩＬ－２，ＩＬ－４，ＧＭ－ＣＳＦ，γ－ＩＦＮ等细胞因子被转录，导致Ｔ细 胞增生。当ＣｓＡ进入细胞后，它在胞浆中与ＣｙＰＡ结合形成ＣｓＡ－ＣｙＰＡ复合物，此复合物进一步与ＣＮ相互作用，使ＣＮ失去磷酸化酶活性，一些核因子ＮＦ－ＡＴ（激活的Ｔ细胞性核因子），ＮＦ－Ｂκ（κ链相关Ｂ细胞性核因子）等不能被去磷酸化和转位，从而不能与核内ＩＬ－２等基因启动子结合造成其转录抑制，从而阻断Ｔ细胞增生，使Ｔ细胞处于Ｇ０期，不能向Ｇ１
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